自噬標志物LC3的節律表達破壞參與β1-AA誘導的H9c2大鼠心肌細胞死亡*

賈微微， 寧 娜， 孫 聰， 李朋佳， 陸潔蓓， 張 晟，原 媛 ， 王 麗 ，3， 王曉暉 ，3△

（山西醫科大學基礎醫學院 1病理教研室，2形態學實驗室，3基礎醫學研究中心，山西太原030001）

心功能不全是多種心臟疾病的終末階段，是重要的全球公共健康問題，但發病機制尚未完全闡明［1］。研究表明，在40%～60%心功能不全患者血清中可檢測到針對自身β1-腎上腺素受體（β1-adrenergic receptor，β1-AR）產生的自身抗體（β1-AR autoantibodies，β1-AA）［2］。β1-AA 可以持續激活 β1-AR 導致心肌細胞死亡，從而參與心功能不全的發生發展［3］。然而，β1-AA引起心肌細胞死亡的機制尚不明確。

自噬是一種細胞自主的防御機制，可將細胞質內的一些物質運輸到溶酶體內進行消化降解［4］。自噬被認為是細胞死亡和存活之間的交匯點，可以保護心肌細胞免于凋亡和其他重大傷害［5］。早在1970年，Pfeifei［6］在電鏡下就觀察到小鼠心肌、視網膜和胰腺等多種組織細胞中存在自噬體數量的節律性波動。自噬標志蛋白微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3）的表達水平在小鼠肝臟中也呈現出顯著的震蕩節律［7-8］。

特異性敲除小鼠心肌自噬相關基因ATG5可以使自噬的節律喪失，誘導心功能下降［9］，提示自噬震蕩節律的異常可以影響心肌細胞。然而，β1-AA 對心肌細胞自噬標志物LC3 的節律表達是否有影響及其對心肌細胞死亡的作用目前尚不清楚。因此，本研究用β1-AR 細胞外第二環（the second extracellular loop of β1-AR，β1-AR-ECII）抗原肽段主動免疫大鼠，再將從大鼠血清中提純的β1-AA作用于H9c2大鼠心肌細胞，觀察LC3 的節律性表達，探究自噬節律的破壞是否參與β1-AA 誘導的心肌細胞死亡，以期為β1-AA陽性心功能不全患者的治療提供實驗參考資料。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物及細胞 清潔級8 周齡雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠12只，體質量180～200 g，由山西醫科大學動物中心［許可證號：SCXK（晉）2015-0001］提供。H9c2細胞系由中國科學院上海細胞庫提供。

1.2 主要試劑 β1-AR-ECII 抗原肽段（吉爾生化上海有限公司）；抗LC3 抗體和抗Per2 抗體（Abcam）；抗GAPDH 抗體、辣根過氧化酶標記的山羊抗小鼠IgG 和辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG（中杉金橋公司）；RNAiso Plus、PrimeScript RT Master Mix 和SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa）；胎牛血清（中喬新舟公司）；Cell Counting Kit-8（CCK-8；Dojindo）；地塞米松（索萊寶科技有限公司）；慢病毒（lentivirus，LV）-shPer2 和LV-NC（中國漢恒生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器 Heracell 150i CO2恒溫細胞培養箱（Thermo Scientific）；酶聯免疫檢測儀（SoftMax）；LR56495 低溫高速離心機（Thermo Fisher）；PCR 擴增儀（Stratagene）；熱循環儀（MJ Research）；垂直電泳儀和半干轉轉膜儀（BIO-RAD）；BioSpectrum 810 凝膠成像系統（UVP）。

2 實驗方法

2.1 建立主動免疫大鼠模型 參照文獻進行大鼠主動免疫［10］，誘導其血清中產生β1-AA，具體實驗設計見圖1A。選取12 只8 周齡雄性SD 大鼠按隨機數字表法分為免疫組（β1-AR 組）和對照（control）組，每組6 只。使用Na2CO3溶液溶解β1-AR-ECII 抗原肽段，按1∶1的比例與完全弗氏佐劑乳化混勻后，于SD大鼠背部皮下多點注射法進行首次免疫（0.4 μg/g），隨后將已稀釋的β1-AR-ECII 抗原肽段與不完全弗氏佐劑1∶1乳化，采用單點背部皮下注射，每隔2周加強免疫 1 次，共免疫 8 周；control 組用等量 Na2CO3溶液替代抗原溶液，實驗方案同免疫組。隨后從血清中檢測并提純β1-AA。

2.2 鏈霉抗生物素蛋白（streptavidin，SA）-酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測β1-AA 使用β1-AR-ECII 抗原肽段（10 mg/L）包被空白ELISA 板，加入磷酸鹽緩沖液、待測血清、生物素標記的Ⅱ抗和辣根過氧化物酶標記的SA，且以上各步驟均在37℃水浴1 h；底物顯色30 min；最后檢測405 nm 處吸光度（A），計算P/N 值判定結果。P/N=（標本A值-空白對照A值）/（陰性對照A值-空白對照A值），P/N≥2.1 定為抗體陽性，P/N≤1.5定為抗體陰性。

2.3 純化β1-AA 冰箱取出層析柱放置室溫30 min，三蒸水沖洗保存在柱子中的乙醇，用結合緩沖液沖洗柱子，使用含有β1-AA 的血清濾過柱子并用洗脫緩沖液沖洗柱子，使β1-AA 隨同洗脫緩沖液一起滴到EP管中。

2.4 細胞培養及處理 培養H9c2 細胞至匯合度達80%左右時用終濃度0.1 μmol/L［11］的地塞米松溶液同步化處理3 h，同步化結束時間記為CT0。細胞隨機分為 4 組：control 組（1 μmol/L 陰性 IgG 處理細胞）、β1-AA組（1 μmol/L β1-AA處理細胞）、LV-NC組（LV-NC 感染細胞，MOI=30）和 LV-shPer2 組（LV-shPer2 感染細胞，MOI=30）。各組細胞分別在同步化并給藥誘導之后于不同時點（CT0、CT4、CT8、CT12、CT16和CT20）收樣，用于后續研究。

2.5 通過慢病毒感染敲減Per2基因 參照文獻［12］，采用慢病毒感染H9c2 細胞以敲減Per2基因，進而得到LC3 節律異常的細胞。由上海漢恒生物科技有限公司協助構建含shPer2 質粒同時帶有GFP 的慢病毒。采取1/2小體積感染法：前一日進行細胞計數和傳代，次日細胞換液后加入1/2 體積培養基，根據最佳MOI加入適宜體積的慢病毒，感染4 h后加入另外1/2 體積新鮮培養基，12～16 h 后將含病毒的培養基換為普通完全培養液。

2.6 Western blot 實驗 采用Western blot 法檢測各時點LC3 和Per2 蛋白的表達。同2.4 處理后于各時點收集細胞，BCA法測蛋白濃度，定量的蛋白經SDSPAGE分離后，轉至PVDF膜，奶粉室溫封閉2 h，相應抗體4℃孵育過夜，TBST 洗膜后加入相應Ⅱ抗室溫孵育2 h。利用凝膠成像系統曝光，使用ImageJ 軟件對圖像進行灰度分析。

2.7 real-time PCR 實驗 采用 real-time PCR 檢測Per2 mRNA 表達和各時點LC3 mRNA 表達。將各組細胞處理，充分裂解后收集細胞，提取總RNA 并反轉錄為cDNA，使用SYBR Green 試劑盒擴增cDNA 產物。引物設計如下：LC3 的上游引物序列為5′-AGCTCTGAAGGCAACAGCAACA-3′，下游引物序列為 5′-GCTCCATGCAGGTAGCAGGAA-3′；GAPDH 的上游引物序列為5′-GGCACAGTCAAGGCTGAGAATG-3′，下游引物序列為 5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′；Per2 的上游引物序列為 5′-AGCAACACCACCTTTCACAA-3′，下 游引 物序 列為 5′-CGTAGGCTTAGACCACCATC-3′。所有結果用control組 CT0 時 GAPDH 的表達進行標化，采用 2-ΔΔCt法進行相對定量。

2.8 CCK-8 法檢測細胞活力 將密度為每孔（2～3）×104的細胞懸液接種于96 孔板，待細胞貼壁后更換培養基并對各組細胞進行加藥處理；藥物作用24 h 后每孔加入CCK-8 溶液10 μL，混勻后繼續孵育1.5 h；最后檢測450 nm 處A值，對各組A值進行處理分析得到其相較于control 組細胞的相對活力。計算公式為：細胞相對活力（%）=（實驗組A值-空白對照組A值）/（陰性對照組A值-空白對照組A值）×100%。

3 統計學處理

實驗數據采用SPSS 16.0 軟件進行分析，以均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法。檢驗水準α=0.05。

采用R 統計軟件包2.10.0 版進行JTK_CYCLE算法［13-15］來識別數據的循環變量，以查看24 h 節律。JTK_CYCLE 算法是一種可以從微陣列數據中檢測循環記錄的非參數測試程序，提供每個循環記錄的基于置換的P值（校正的P值），其所需的置信區間為95%。

結 果

1 主動免疫大鼠血清中β1-AA的A值顯著升高

SA-ELISA 結果顯示，與 control 組（0.65±0.02）相比，β1-AR 組大鼠血清中 β1-AA 的A值（2.47±0.07）顯著升高（P＜0.05），進一步采用親和層析法提純β1-AA，用于后續細胞實驗，見圖1。

2 β1-AA顯著降低H9c2細胞活力

CCK-8 結果顯示，與 control 組相比，1 μmol/L 的β1-AA 作用于H9c2心肌細胞24 h后細胞活力顯著下降（P＜0.05），見圖2。

3 β1-AA破壞H9c2細胞LC3的節律表達

real-time PCR 及 Western blot 結果顯示，control組LC3 mRNA 和蛋白表達水平均在CT8～CT12 時升高，CT12 以后開始下降；經β1-AA 處理后，LC3 的表達高峰前移至CT8，見圖3。

使用JTK_CYCLE 算法對所得數據進行分析，可得到 control 組 LC3 的 JTK_CYCLEP值小于 0.05，經β1-AA 處理后，LC3 的 JTK_CYCLEP值大于 0.05，見表1。

4 β1-AA破壞H9c2細胞Per2蛋白的節律表達

Western blot 結果顯 示 ，control 組 Per2 蛋白在CT8 和 CT16 時表達較高，其中以 CT16 時最高；經 β1-AA 處理后，Per2 蛋白的生成高峰前移至CT12，見圖4。

使用JTK_CYCLE 算法對所得數據進行分析，結果表明 control 組 Per2 蛋白的 JTK_CYCLEP值小于0.05，經β1-AA 處理后，JTK_CYCLEP值大于0.05，見表1。

Figure 1.Detection and purification of β1-AA from rat serum.A：diagram of detection and purification of β1-AA；B：serum β1-AA level in control group and β1-AR active immunization group was determined by SA-ELISA.Mean±SEM. n=6. *P＜0.05 vs control group.圖1 β1-AR主動免疫后檢測及提純β1-AA

Figure 2.β1-AA decreased the viability of H9c2 cells.Mean±SEM. n=6. *P＜0.05 vs control group.圖2 β1-AA顯著降低H9c2細胞活力

5 敲減Per2 基因破壞H9c2 細胞LC3 節律表達后細胞活力顯著降低

5.1 慢病毒感染成功敲減H9c2 細胞的Per2基因采用LV-shPer2感染H9c2細胞，MOI=30時熒光強度較高且與MOI=50 時差異不大（圖5A），故選定MOI為30用于后續實驗。隨后檢測病毒對目的基因Per2的敲減效果，結果顯示，與LV-NC 感染的H9c2 細胞（3.69±0.26）相比 ，LV-shPer2 感 染 使 H9c2 細胞Per2 mRNA 表達水平（1.98±0.37）顯著降低（P＜0.05），見圖5B；Per2 蛋白表達也顯著降低（1.22±0.25vs0.56±0.09，P＜0.05），見圖5C。

5.2 慢病毒感染敲減Per2基因破壞H9c2 細胞LC3的節律表達 Western blot 結果顯示，LV-NC 組LC3節律表達與control 組類似，且JTK_CYCLE 算法分析的P值 小 于 0.05，而 LV-shPer2 組 LC3 的 JTK_CYCLEP值大于0.05，見圖6及表1。

5.3 LC3 節律表達破壞可引起H9c2 細胞活力下降 CCK-8 結果顯示，LV-NC 組 H9c2 細胞活力（96.90%±6.42%）與 control 組（97.50%±1.43%）相比無顯著差異，而破壞LC3 節律表達后，細胞活力顯著下降（37.95%±3.76%，P＜0.05），見圖7。

討 論

本研究觀察到，β1-AA 可以誘導H9c2 心肌細胞自噬標志物LC3 的節律表達破壞。研究表明，自噬節律表達受生物鐘基因調控，于是本研究采用LV-shPer2 敲減生物鐘基因Per2以破壞細胞自噬標志物LC3 的節律表達，觀察到心肌細胞活力顯著下降，提示自噬標志物LC3 的節律表達破壞促進β1-AA 誘導的H9c2心肌細胞死亡。

β1-AA 是一種針對β1-AR-ECII 產生的自身抗體［16］，可以持續激活β1-AR導致心肌細胞死亡［3］。β1-AA可以通過結合β1-AR的構象表位而影響受體的構象和下游cAMP 信號傳導，進而誘導MCP-1 蛋白產生，引起心肌細胞死亡［17］。β1-AA 還可以通過誘導CD4+T 細胞增加，導致心肌細胞凋亡和心力衰竭［18］。本研究也觀察到β1-AA作用H9c2心肌細胞24 h可顯著降低心肌細胞活力，與之前的研究一致。

我們前期研究結果表明，β1-AA 可顯著抑制心肌細胞自噬功能，繼而導致線粒體膜電位下降，參與心功能不全的發生發展［19］。自噬在生理過程中起著“管家”的作用，可以清除長壽、錯誤折疊的蛋白質和受損的細胞器，參與細胞生長和衰老的調節［20］。已有研究表明，細胞自噬存在節律性震蕩［21］；早在1970年就觀察到大鼠某些組織自噬空泡的豐度在一日中具有節律性波動［6］；另有研究表明，LC3-II 蛋白表達在小鼠肝臟、骨骼肌及腎臟中也具有節律性［22］。LC3作為自噬的分子標記物位于細胞質中，自噬發生時LC3-I 與磷脂酰乙醇胺共價結合，形成LC3-II 并定位于自噬體膜上參與自噬小體的形成［23］。在本研究中，我們重點關注自噬標志物LC3 的節律表達情況。為了對相關蛋白在24 h 的節律變化進行分析，我們采用的是公認的晝夜節律震蕩性分析軟件JTK_CYCLE［24-25］。JTK_CYCLE 是一種新穎的非參數統計算法，采用R 語言來識別樣本的循環變量。而且本研究以H9c2 大鼠心肌細胞系為研究對象，細胞系的節律不會被環境變化所加強，所以節律性震蕩較低，但是經過與其他算法相比較，JTK_CYCLE 算法能很好識別這些數據中的循環轉錄本。而且JTK_CYCLE算法對于24 h內的樣本數據較其他算法相比具有更高的特異性和準確性［13-15］。我們的結果顯示，control組LC3 的表達確實存在顯著節律性震蕩，LC3 在CT8～CT12時升高，CT12開始下降，提示在主觀白天LC3 的生成處于較低狀態，心肌細胞產生的衰老、損傷的蛋白質會出現累積，主觀夜間LC3 的生成增多，自噬開始發揮吞噬降解衰老損傷的蛋白質及細胞器的作用，維持心肌細胞的正常狀態。由此可見，自噬節律的正常運轉對于心肌細胞穩態的維持至關重要。而給予β1-AA 處理后LC3 生成的最高點由CT12提前至CT8，JTK_CYCLE 算法分析得出其節律性震蕩被破壞。這提示β1-AA可以引起H9c2心肌細胞自噬標志物LC3的節律表達破壞。

Figure 3.Autophagy marker LC3 rhythm was disrupted in H9c2 cardiomyocytes by β1-AA.The samples were collected every 4 h within 24 h.A：real-time PCR demonstrated that the LC3 mRNA rhythmic expression in the H9c2 cardiomyocytes was disrupted by β1-AA（1 μmol/L）；B，C：Western blot showed that the LC3 protein rhythmic expression in the H9c2 cardiomyocytes was disrupted by β1-AA（1 μmol/L）.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖3 β1-AA破壞H9c2心肌細胞自噬標志物LC3的節律表達

Figure 4.The rhythmic expression of Per2 protein in H9c2 cardiomyocytes was disrupted by β1-AA（1 μmol/L）.The samples were collected every 4 h within 24 h.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group.圖4 β1-AA破壞H9c2心肌細胞Per2蛋白的節律表達

Figure 5.H9c2 cells were infected with LV-shPer2 to knock down the expression of Per2.A：GFP fluorescence images with MOI of 5，10，30 and 50（scale=1 mm）；B：real-time PCR showed that the mRNA expression of Per2 was reduced by LV-shPer2（MOI=30）in the H9c2 cardiomyocytes；C：Western blot showed that the protein expression of Per2 was reduced by LV-shPer2（MOI=30）in the H9c2 cardiomyocytes.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs LV-NC group.圖5 LV-shPer2感染H9c2心肌細胞敲減Per2的表達

Figure 6.The expression of LC3 rhythm was disrupted after LV-shPer2 infection.The samples were collected every 4 h within 24 h.A：real-time PCR demonstrated that the LC3 mRNA rhythmic expression in the H9c2 cardiomyocytes was disrupted by LV-shPer2（MOI=30）；B，C：Western blot showed that the LC3 protein rhythmic expression in the H9c2 cardiomyocytes was disrupted by LV-shPer2（MOI=30）Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs LV-NC group.圖6 LV-shPer2敲減Per2使心肌細胞自噬標志物LC3節律破壞

研究表明，人類清醒時，饑餓增加胰島素水平，進而激活心臟mTOR 信號通路，導致自噬節律異常，從而發生心功能不全［9，26］。FoxO3 誘導心肌細胞中幾種自噬相關基因節律性異常表達，導致心肌細胞變小，心功能下降［27］。這些研究表明，自噬節律異常可能會對心肌細胞和心功能產生影響。因此，我們需要進一步探究β1-AA誘導的H9c2心肌細胞自噬標志物LC3的節律表達破壞是否參與其細胞死亡。

自噬的震蕩節律受生物鐘調控［28］。生物晝夜節律是地球上所有生物體以太陽作為參考點將生物周期調整為近似24 h 的震蕩節律。轉錄-翻譯反饋環路（transcriptional translation feedback loop，TTFL）是目前公認的節律維持機制［29］。其中，β-AR活化能夠顯著改變 Per2 蛋白和 mRNA 的節律性表達［30］，即 β-AR 的激活會引起生物鐘基因Per2的變化。而且本研究也觀察到，H9c2心肌細胞control組的Per2蛋白通過JTK_CYCLE 算法分析表現出顯著的晝夜節律性震蕩，其表達量于CT8 和CT16 時相對較高，其中以CT16 時最高；而β1-AA 能夠顯著破壞 Per2 蛋白的晝夜節律性震蕩，使其生成最高峰前移至CT12。有研究表明，成纖維細胞Per2基因沉默后，LC3蛋白表達顯著下降，節律也出現顯著異常［31］。因此，本研究使用LV-shPer2 感染H9c2 心肌細胞，降低Per2表達，進而破壞自噬標志物LC3 的節律表達，結果細胞活力出現顯著下降，表明β1-AA 誘導的H9c2 心肌細胞自噬標志物LC3 的節律表達破壞了參與其細胞死亡。

表1 JTK_CYCLE 算法分析LC3 mRNA、LC3 蛋白和Per2蛋白表達的晝夜節律參數Table 1.The circadian parameters of LC3 mRNA，LC3 protein and Per2 protein using JTK_CYCLE algorithm analysis

Figure 7.The viability of H9c2 cardiomyocytes was reduced after the rhythm of LC3 was destroyed by LV-shPer2.Mean±SEM. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LV-NC group.圖7 LV-shPer2 敲減Per2 基因使心肌細胞LC3 節律表達破壞后心肌細胞的活力顯著降低

綜上所述，β1-AA 可引起H9c2 心肌細胞自噬標志物LC3 的節律表達破壞和細胞活力降低；敲減生物鐘基因來破壞H9c2 心肌細胞LC3 節律表達后，細胞活力顯著下降。由此可見，自噬標志物LC3 節律表達的破壞在β1-AA 誘導的心肌細胞死亡過程中發揮重要作用；早期合理調控自噬標志物LC3 的節律表達有望成為β1-AA 陽性心功能不全患者的治療策略。