ECE1過(guò)表達(dá)通過(guò)eNOS/NO通路促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞肥大和凋亡*

樊瓊玲， 張雪蓮， 楊 菲， 劉 濤， 趙 軍， 張石蕾， 由淑萍△

（新疆醫(yī)科大學(xué) 1護(hù)理學(xué)院，2公共衛(wèi)生學(xué)院，3新疆維吾爾自治區(qū)藥研所，新疆烏魯木齊830011）

心臟肥大（cardiac hypertrophy）是心臟長(zhǎng)期處于壓力超負(fù)荷下的一種常見(jiàn)的適應(yīng)性反應(yīng)，其持續(xù)進(jìn)展會(huì)導(dǎo)致心力衰竭［1-3］。研究表明，在心臟肥大的動(dòng)物及細(xì)胞模型中，心肌細(xì)胞凋亡水平升高，增殖減少［3-4］。內(nèi)皮素轉(zhuǎn)換酶 1（endothelin-converting enzyme 1，ECE1）是血管收縮肽內(nèi)皮素1（endothlin 1，ET-1）生成的限速酶，是ECE 家族的主要成員，在肺、心臟、血管內(nèi)皮組織等重要器官均有表達(dá)，主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，對(duì)于調(diào)節(jié)ET-1 的生成和多種信號(hào)通路具有重要意義［5-6］。ET-1 與血管舒張物質(zhì)一氧化氮（nitric oxide，NO）相互協(xié)調(diào)，共同控制血管的舒縮［7-8］。本課題組前期在壓力超負(fù)荷大鼠心臟肥大模型中觀察到ECE1基因甲基化水平降低和磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthesis，eNOS）通路抑制［9-10］。但ECE1 在心臟肥大發(fā)生過(guò)程中與eNOS/NO信號(hào)通路的作用及具體機(jī)制仍不清楚。本研究旨在探討過(guò)表達(dá)ECE1 對(duì)血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ）誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)大鼠H9C2 心肌細(xì)胞肥大和凋亡水平的影響及其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)主要材料

H9C2 大鼠心肌細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。ECE-1 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（pEX-3-ECE1）和空載質(zhì)粒（pEX-3-NC）購(gòu)自上海吉瑪有限公司；Ang Ⅱ購(gòu)自APExBIO；DMEM 培養(yǎng)液、磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、胎牛血清、胰蛋白酶和雙抗溶液購(gòu)自BI；Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen；4×上樣緩沖液和NO 含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Solarbio；彩虹蛋白Marker 和BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo；FITC 偶聯(lián)的Annexin-Ⅴ凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD Biosciences Pharmingen；快速質(zhì)粒小量抽提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；兔抗p-eNOS 和 β-actin 單克隆抗體購(gòu)自 Bioss；兔抗 Bax 單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology；兔抗Bcl-2單克隆抗體購(gòu)自Proteintech。基因擴(kuò)增儀和Western blot相關(guān)實(shí)驗(yàn)儀器購(gòu)自Bio-Rad；FluorChem E 凝膠成像儀購(gòu)自ProteinSimple。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 H9C2 心肌細(xì)胞用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM 培養(yǎng)液，于37℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)密度至90%后以0.25% 胰酶消化，按 1∶2 或 1∶3 傳代，以含 10% 二甲基亞砜的胎牛血清凍存細(xì)胞。選取生長(zhǎng)良好的H9C2 細(xì)胞，隨機(jī)分為空白對(duì)照（control）組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+ECE1 過(guò)表達(dá)（Ang Ⅱ+ECE1）組和 AngⅡ+陰性對(duì)照（Ang Ⅱ+NC）組。后兩組先轉(zhuǎn)染pEX-3-ECE1或pEX-3-NC后進(jìn)行Ang Ⅱ刺激。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d，用胰酶消化細(xì)胞，計(jì)數(shù)后接種于6 孔板中，以DMEM 培養(yǎng)液稀釋質(zhì)粒pEX-3-ECE1 及pEX-3-NC，與轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000充分混合后，靜置20 min，于37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h后，棄去原培養(yǎng)液更換為含10%胎牛血清的培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h。

2.3 RT-qPCR 檢測(cè) mRNA 表達(dá)水平 以 Trizol 法提取H9C2 心肌細(xì)胞的總RNA 后純化，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 純度，要求A260/A280＞1.8。反轉(zhuǎn)錄RNA為cDNA，取 2 μL 產(chǎn)物進(jìn)行擴(kuò)增，20 μL 反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為：95℃ 30 s；95℃ 3 s，60℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 60 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，以 2-ΔΔCt法分析ECE1、ANP 和BNP mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。ECE1 的上游引物序列為5′-TCATCGGCTCACTCTCCAACTCC-3′，下 游 引 物 序 列 為 5′-CCTTCTTCCACCTGTGTTCTCTGC-3′；ANP 的上游引物序列為5′-GAGAGCGGACTAGGCTGCAA-3′，下游引物序列為 5′-TCAGTGGCAAlGCGACCAA-3′；BNP 的上游引物序列為 5′-CGGATTGGCGCAGTCAGTCG-3′，下游引物序列為 5′-AGAGCCGCAGGCAGAGTCAG-3′；內(nèi)參照β-actin 的上游引物序列為5′-TGTCACCAACTGGGAGGATA-3′，下游引物序列為 5′-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3′。

2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將各組細(xì)胞接種于96 孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞+100 μL 培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，每孔加入CCK-8 溶液10 μL，37℃孵育2 h，在酶標(biāo)儀中檢測(cè)450 nm處的吸光度（A450值）。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)孔A450值-空白孔A450值）/（對(duì)照孔A450值-空白孔A450值）×100%。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 PBS 清洗細(xì)胞2次后，加入胰酶消化細(xì)胞，離心后計(jì)數(shù)，將細(xì)胞接種于6孔板，每孔 5×106個(gè)，培養(yǎng) 24 h 后收集細(xì)胞；用 PBS 洗滌，加入300 μL 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，再加入5 μL Annexin V-FITC 后混勻，室溫下避光15 min；上機(jī)前5 min 加入 5 μL 碘化丙啶及 200 μL 結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞術(shù)分析心肌細(xì)胞的凋亡水平。

2.6 Western blot 法檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 預(yù)冷的PBS 清洗細(xì)胞 2 次后，加入 100 μL RIPA 裂解液和 1 μL蛋白酶抑制劑（或1 μL蛋白磷酸酶抑制劑），每隔5 min 吹打一次細(xì)胞，30 min 后用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，收集細(xì)胞后以12 879×g離心20 min后，用移液器吸取上清。BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，取30 μg 樣品，加入上樣緩沖液，在100℃下熱變性5 min，10%SDSPAGE 分離蛋白后，電轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride，PVDF）膜，5%脫脂牛奶封閉2 h。將PVDF 膜加入Ⅰ抗中，4℃孵育過(guò)夜，TBST 溶液洗3次，每次5 min；加入Ⅱ抗，室溫孵育1 h，TBST溶液洗3 次，每次10 min。在FluorChem E 凝膠成像儀上拍照并分析條帶灰度值，每個(gè)條帶重復(fù)測(cè)量3 次，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

2.7 硝酸還原酶法檢測(cè)NO 含量 根據(jù)NO 含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)H9C2 細(xì)胞培養(yǎng)液中的NO 含量。試劑混勻后，4℃靜置15 min，以對(duì)照管調(diào)零，用1 mL 玻璃比色皿測(cè)定各組波長(zhǎng)550 nm 處的吸光度（A550值），根據(jù)所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO含量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 25.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 轉(zhuǎn)染后H9C2 心肌細(xì)胞中ECE1 的mRNA 及蛋白表達(dá)水平的變化

RT-qPCR 和Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組ECE1的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過(guò)表達(dá)組ECE1 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步增加（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

Figure 1.The expression of ECE1 in H9C2 cells after transfection.A：the mRNA expression level of ECE1；B：the protein expression level of ECE1.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖1 轉(zhuǎn)染后ECE1的mRNA及蛋白表達(dá)水平

2 過(guò)表達(dá)ECE1對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中心臟肥大因子ANP和BNP mRNA表達(dá)的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組ANP和BNP的mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1過(guò)表達(dá)組ANP和BNP的mRNA表達(dá)水平進(jìn)一步升高（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 過(guò)表達(dá)ECE1對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞活力影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，AngⅡ組H9C2細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞活力進(jìn)一步下降（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

Figure 2.The effect of ECE1 over-expression on the mRNA expression of cardiac hypertrophy factors ANP and BNP in Ang Ⅱ-induced H9C2 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖2 過(guò)表達(dá)ECE1 對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2 心肌細(xì)胞中心臟肥大因子ANP和BNP mRNA表達(dá)的影響

Figure 3.The effect of ECE1 over-expression on the viability of Ang Ⅱ -induced H9C2 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖3 過(guò)表達(dá)ECE1對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2細(xì)胞活力的影響

4 過(guò)表達(dá)ECE1對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡水平的影響

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，AngⅡ組H9C2細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞凋亡率進(jìn)一步升高（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

5 過(guò)表達(dá)ECE1 對(duì)凋亡相關(guān)蛋白Bax 和Bcl-2 表達(dá)的影響

Western blot 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組促凋亡蛋白Bax 表達(dá)水平顯著升高，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05）；與AngⅡ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過(guò)表達(dá)組Bax 蛋白表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2 蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

Figure 4.The effect of ECE1 over-expression on the apoptosis level of Ang Ⅱ-induced H9C2 cells.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖4 過(guò)表達(dá)ECE1對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞凋亡水平的影響

Figure 5.The effect of ECE1 over-expression on apoptosis proteins of Ang Ⅱ-induced H9C2 cells.A：the Western blot pictures of Bax and Bcl-2.B：the relative protein expressions of Bax and Bcl-2.Mean±SD.n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱgroup group.圖5 過(guò)表達(dá)ECE1對(duì)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中凋亡蛋白Bax和Bcl-2的影響

6 過(guò)表達(dá)ECE1對(duì)eNOS蛋白及NO水平的影響

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，各組eNOS蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著差異（P＞0.05），見(jiàn)圖6A。與空白對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組p-eNOS 蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與 Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過(guò)表達(dá)組 peNOS 蛋白水平進(jìn)一步降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6A。NO含量檢測(cè)顯示，與空白對(duì)照組相比，Ang Ⅱ組的NO含量顯著降低（P＜0.05）；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+ECE1 過(guò)表達(dá)組的NO 含量進(jìn)一步降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6B。

討 論

心臟肥大是高血壓、冠心病等心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［11-12］，但其病理生理機(jī)制尚未闡明。ET-1是一種強(qiáng)大的血管收縮肽，已被證明是心臟肥大過(guò)程中的重要參與因子［13］。作為ET-1 生成最后一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶，ECE1 在調(diào)節(jié)ET-1 生成與心臟肥大的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究證實(shí)，ECE1在Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟肥大過(guò)程中表達(dá)顯著增加，ECE1下調(diào)可顯著抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心臟肥大［14］。在本研究中，我們觀察到過(guò)表達(dá)ECE1會(huì)顯著促進(jìn)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)H9C2 心肌細(xì)胞中心臟肥大因子ANP和BNP 的mRNA 表達(dá)，并顯著降低心肌細(xì)胞活力，證明ECE1與Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大有密切關(guān)系。

Figure 6.The effect of ECE1 over-expression on eNOS/NO signaling pathway.A：the protein expression levels of p-eNOS and eNOS detected by Western blot；B：the NO level.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs Ang Ⅱ group.圖6 過(guò)表達(dá)ECE-1對(duì)eNOS/NO信號(hào)通路的影響

NO 與ET-1 是在血液循環(huán)中的一對(duì)血管舒張因子和收縮因子，在調(diào)節(jié)血管活動(dòng)和血壓中起到了重要作用［7，15］。研究表明，ET-1 可以通過(guò) PI3K 途徑、鈣離子依賴途徑及Rho kinase 途徑等調(diào)控eNOS/NO通路，以調(diào)節(jié) NO 的生成［16］。在肺內(nèi)皮細(xì)胞中 NO 生成的一個(gè)重要途徑是內(nèi)皮素B 型受體介導(dǎo)的eNOS的激活［17］。我們?cè)谇捌趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)到ECE1 在壓力超負(fù)荷大鼠左室心肌組織中表達(dá)升高，且伴隨eNOS/NO 通路的激活［10］。因此，本研究通過(guò)Western blot和硝酸還原法檢測(cè)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞中eNOS/NO信號(hào)通路的水平，并且通過(guò)ECE1過(guò)表達(dá)觀察其是否對(duì)eNOS/NO 信號(hào)通路有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞中eNOS 總蛋白水平?jīng)]有顯著差異，但p-eNOS 蛋白水平及NO 含量在Ang Ⅱ的誘導(dǎo)下顯著升高，且過(guò)表達(dá)ECE1 可進(jìn)一步提高p-eNOS 蛋白水平及 NO 含量，表明 ECE1 可能通過(guò) eNOS/NO 通路調(diào)節(jié)Ang Ⅱ誘導(dǎo)的H9C2心肌細(xì)胞肥大。

心肌細(xì)胞凋亡水平上升和增殖受阻是多種心血管疾病的重要病理過(guò)程，壓力超負(fù)荷下的心肌細(xì)胞易發(fā)生凋亡和壞死［18］。已有研究證實(shí)，在阿霉素誘導(dǎo)的心肌病中，eNOS途徑的激活可以介導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡下降［19］。Hoffmann 等［20］的研究表明，eNOS敲除在內(nèi)皮細(xì)胞中顯示出顯著增強(qiáng)的凋亡誘導(dǎo)作用。為證實(shí)ECE1是否可以通過(guò)調(diào)控eNOS途徑而對(duì)心肌細(xì)胞的凋亡產(chǎn)生作用，我們通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了ECE1 過(guò)表達(dá)后的凋亡水平及相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)ECE1后Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡率及Bax 表達(dá)水平顯著上升，而B(niǎo)cl-2 表達(dá)水平顯著降低。這表明ECE1 可能通過(guò)抑制eNOS/NO信號(hào)通路調(diào)節(jié)H9C2心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，本研究顯示，過(guò)表達(dá)ECE1 可降低Ang Ⅱ誘導(dǎo)的體外培養(yǎng)H9C2 心肌細(xì)胞活力，促進(jìn)心肌細(xì)胞肥大和凋亡，其機(jī)制可能與過(guò)表達(dá)ECE1 后eNOS/NO信號(hào)通路的抑制有關(guān)。