體外肺癌上皮-間充質轉化三維模型的建立及其對順鉑抵抗的機制研究*

徐 煒， 王 劍， 宋 嘉， 陳清勇

（中國人民解放軍第903醫院，浙江杭州310013）

既往研究表明，上皮-間充質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）與腫瘤的惡性生物學行為、藥物抵抗和復發密切相關［1-2］。然而在經典的腫瘤EMT及耐藥性研究方面，目前仍主要采用二維細胞培養（two-dimensional cell culture，2DCC）及動物腫瘤模型。而隨著腫瘤研究的不斷深入，腫瘤微環境的重要性已備受人們關注［3］，由于二維培養缺少細胞外基質（extracellular matrix，ECM）環境，無法進行腫瘤細胞之間、腫瘤細胞與微環境之間的交互研究；而動物實驗周期較長，并且涉及到倫理道德、個體差異、免疫排斥和種屬差異等問題，導致許多人類腫瘤模型無法在動物體內復制，而且動物實驗最終呈現的是實驗結果，但實驗的中間過程是難以被觀察的。

體外三維細胞培養（three-dimensional cell culture，3DCC）是介于動物實驗與二維平面細胞培養之間的實驗技術，該技術滿足細胞培養的直觀和條件可控性的基礎上，盡可能模擬體內腫瘤細胞三維形態及功能，在模擬細胞與細胞之間、細胞與基質微環境相互作用方面具有獨特的優勢［4］。而體外肺癌三EMT 模型尚無文獻報道，本研究擬采用三維培養技術在體外構建肺癌三維模型，并用轉化生長因子β1（transform growth factor-β1，TGF-β1）誘導形成三維EMT肺癌模型，并對其形態、蛋白表達和藥物敏感性進行研究，揭示三維培養肺癌細胞發生EMT 和順鉑抵抗的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 細胞株 人非小細胞肺癌細胞系95D 購自中科院上海細胞生物研究所。

1.2 主要試劑 胎牛血清和RPMI-1640 培養液購自 Gibco；TGF-β1 購自 PeproTech；順鉑注射液購自齊魯制藥公司；瓊脂購自Gene；氯化鈣顆粒（分析純）購自天津市永大化學試劑有限公司；海藻酸鈉購自Sigma；兔抗人E-cadherin、N-cadherin、vimentin、AKT、mTOR、p-AKT 和 p-mTOR 抗體均購自 Cell Signaling Technology；抗GAPDH 抗體購自Abcam；羊抗兔IgGⅡ抗購自杭州聯川生物有限公司；熒光羊抗兔IgGⅡ抗購自Jackson ImmunoResearch。

2 方法

2.1 細胞培養 95D 細胞培養于含10%胎牛血清、青霉素（終濃度為1×105U/L）和鏈霉素（終濃度0.1 mg/L）的 RPMI-1640 培養液，常規置于37℃、5%CO2培養箱中，取對數生長期細胞實驗。

2.2 細胞支架制備 支架材料為瓊脂和海藻酸鈉混合物，材料終濃度為5%，外形為半徑4 mm、高度2 mm 的圓柱形米黃色干燥薄片。前期研究結果表明，該種材料的細胞支架具有無毒、生物兼容性好、降解率低、內部孔隙率高、細胞成球快、成球率高等優點［5］，可用于肺癌細胞三維培養。

2.3 細胞接種 支架在95%乙醇中浸泡1 h 后，用無菌鑷子轉移將支架至24 孔板中，超凈臺內紫外線照射2 h，室溫下晾干，調整細胞濃度為5×108/L，取40 μL 細胞懸液，輕輕添加到支架上，37℃孵育45 min之后加入1 mL培養液，每24 h換液一次。

2.4 EMT 模型誘導及細胞形態觀察 細胞在支架上培養96 h 后基本形成細胞球，此時將培養液更換為含有 5 μg/L TGF-β1、0.5 μmol/L LY294002 或 10 nmol/L rapamycin 的培養液繼續培養3 d，每24 h換液一次。每日用熒光倒置顯微鏡觀察細胞形態變化。72 h 后將支架取出，PBS 柔和漂洗3 次，4%甲醛固定24 h，梯度（50%→75%→95%→100%→100%）乙醇脫水，每次脫水15 min，室溫干燥12 h 后將樣品固定在導電臺上，表面噴金30 s 后在1.5 kV 電壓下用掃描電鏡觀察細胞形態。

2.5 激光共聚焦觀察蛋白表達 棄掉培養液，用PBS 洗 2～3 次，每次 5 min。加 1 mL 濃度為 4% 多聚甲醛，固定細胞，室溫30 min。棄掉固定液，加PBS清洗3 次，每次5 min。棄液后加入1 mL 0.1%Triton X-100，室溫透膜 15 min。棄液后加 PBS 清洗 3 次，每次5 min。5%PBS脫脂乳封閉1 h。加Ⅰ抗，4℃孵育過夜，棄液后加PBS清洗3次，每次5 min。加熒光Ⅱ抗，避光孵育1.5 h，棄液后加PBS 清洗3 次，每次5 min。DAPI 染色 15 min，棄液后加 PBS 清洗 3 次，每次5 min。用鑷子挑起支架，用銳器輕輕刮下支架表面細胞至玻片上，蓋上蓋玻片后，再用激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.6 MTT 法檢測三維培養細胞對順鉑的敏感性將支架均勻裁剪成4 份，95%乙醇浸泡消毒后，用無菌鑷子將支架轉移至96 孔板。調整細胞濃度為5×108/L，取10 μL 細胞懸液，輕輕添加到支架上，孵育30 min 后，加入含有 10%FBS 的培養液，每 24 h 換液1 次。待培養96 h 后，三維培養EMT 組更換為含有5 μg/L TGF-β1 的培養液和順鉑濃度分別為0、2、4、8、16和32 μmol/L 的培養液；三維培養組加入順鉑濃度分別為0、2、4、8、16和32 μmol/L的培養液，繼續培養3 d，每24 h 換液1 次。兩組均設5 個復孔，待培養結束后，于各孔加人20 μL MTT 溶液（5 g/L，無菌PBS配制），37℃溫箱孵育4 h，棄培養液，各孔加入150 μL 二甲基亞砜，搖床避光輕搖10 min，96 孔板離心機低速離心（200×g，5 min），分離支架與上清液，每孔吸100 μL 上清液置于另一96 孔板內，酶標儀在490 nm 處檢測A值，繪制細胞活力抑制率曲線，其中橫坐標為藥物濃度（μmol/L），縱坐標為細胞活力抑制率（%）。

2.7 Western blot 檢測蛋白表達 收集細胞并加入裂解液充分裂解，低溫高速離心（4℃，13 800×g，15 min），提取上清-80℃保存。BCA 法檢測蛋白濃度，煮沸變性后每個泳道加入總蛋白10 μg，8% SDSPAGE 分離后，轉印（300 mA，120 min）到 PVDF 膜上。5%脫脂牛奶或牛血清白蛋白室溫封閉1 h。洗膜后加入Ⅰ抗，4℃孵育過夜。Ⅱ抗（1∶3 000）孵育1.5 h 后洗膜，加入ECL 發光液，凝膠成像系統照相，用ImageJ軟件分析條帶灰度值。

3 統計學處理

以上實驗均至少重復3 次。應用SPSS 13.0 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析（oneway ANOVA），兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 TGF-β1促進三維培養95D細胞EMT

倒置熒光顯微鏡結果顯示，三維培養95D 細胞呈聚集生長，細胞無偽足，細胞球表面較為光滑，細胞球之間存在明顯的界限；當加入TGF-β1 后，原本表面緊實的細胞球出現了細胞離散、遷移，見圖1。

掃描電鏡結果顯示，三維培養95D 細胞呈球形生長，細胞球表明圓滑，而在TGF-β1 刺激后，細胞球出現了塌陷，細胞間的黏附不再緊密，底部細胞有細小偽足出現，細胞向周圍遷移，見圖2。

激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，TGF-β1刺激后E-cadherin 蛋白表達無明顯變化，而N-cadherin 和vimentin蛋白表達上調，見圖3。

Western blot 顯示，TGF-β1 刺激后 E-cadherin 蛋白表達下調（P＜0.01），而N-cadherin 和vimentin 蛋白表達上調（均P＜0.01），見圖4。

Figure 1.The effect of TGF-β1 on the morphological changes of three-dimensionally cultured 95D cells observed by inversed fluorescence microscopy（scale bar=200 μm）.A：control group；B：TGF-β1 group.圖1 倒置熒光顯微鏡觀察TGF-β1 對三維培養95D 細胞形態的影響

Figure 3.The effect of TGF-β1 on the protein expression in three-dimensionally cultured 95D cells observed by laser confocal microscopy（scale bar=100 μm）.A，D：E-cadherin；B，E：N-cadherin；C，F：vimentin.A～C：control group；D～F：TGF-β1 group.圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察TGF-β1 對三維培養95D 細胞蛋白表達的影響

2 LY294002 和 rapamycin 逆轉 TGF-β1 誘導的三維培養95D細胞EMT

熒光倒置顯微鏡觀察顯示，PI3K 抑制劑LY294002 及 mTOR 抑制 劑 rapamycin 可顯 著 抑制TGF-β1刺激后細胞球的離散和遷移，見圖5。

Figure 4.The effect of TGF-β1 on the protein expression in three-dimensionally cultured 95D cells detected by Western blot.Mean±SD. n=4.**P＜0.01 vs control group.圖4 Western blot檢測TGF-β1對三維培養95D細胞蛋白表達的影響

Figure5.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced mesenchymal phenotype of three-dimensionally cultured 95D cells.A：control group；B：TGF-β1 group；C：TGF-β1+LY294002 group；D：TGF-β1+rapamycin group.Scale bar=200 μm.圖5 LY294002和rapamycin逆轉TGF-β1誘導三維培養95D細胞的間充質表型

Western blot 結果顯示，與 control 組比較，TGF-β1 處理三維培養95D細胞可誘導AKT和mTOR磷酸化水平升高（P＜0.05），同時E-cadherin 表達下調（P＜0.05），N-cadherin和vimentin表達上調（P＜0.01）；與TGF-β1 組比較，LY294002 可抑制 AKT 和 mTOR 磷酸化（P＜0.05），上調E-cadherin 蛋白表達（P＜0.05），下調 N-cadherin 和 vimentin 表達（P＜0.01）；與 TGF-β1 組比較，rapamycin 不能抑制 AKT 磷酸化（P＞0.05），但可抑制 mTOR 磷酸化（P＜0.01），上調 E-cadherin 蛋白表達（P＜0.05），下調 N-cadherin 和 vimentin表達（P＜0.01），見圖6。

3 LY294002 和 rapamycin 逆轉 TGF-β1 誘導的三維培養95D細胞順鉑抗性

MTT 結果表明，TGF-β1 可增強三維培養 95D 細胞對順鉑的抵抗，而LY294002 和rapamycin 可逆轉這一現象；計算 IC50值顯示，與 TGF-β1 組［（8.42±0.61）μmol/L］相比，空白組［（6.12±0.54）μmol/L］、LY294002 組［（6.34±0.28）μmol/L］和 rapamycin 組［（6.56±0.03）μmol/L］95D 細胞對順鉑的敏感性均較高（P＜0.01），見圖7。

討 論

肺癌已成為死亡率最高的腫瘤，轉移和耐藥是肺癌治療失敗的重要原因之一，而EMT 與此密切相關［6］。目前關于EMT 的研究基本停留在二維細胞培養模型層面，與二維模型相比，三維培養可以更好地模擬腫瘤微環境，促進細胞外基質的形成，提供更準確的擴散率和細胞形態學特征［7］。從本質上講，三維培養具有與體內相似的腫瘤條件。例如，它們表現出缺氧區、靜止區（干細胞樣）和增殖細胞區、電化學梯度以及細胞-細胞和細胞-微環境相互作用，這與實體腫瘤微環境相似［8］。

三維培養條件下EMT發生時細胞形態是與二維培養不同。EMT 發生后，細胞球可長出鹿角樣和樹枝樣的“觸角”，這些“觸角”是由多個細胞構成管狀三維結構，可向周圍侵襲生長［9］。在蛋白表達方面雖也表現為E-cadherin 下調，vimentin 和N-cadherin等蛋白上調，但與二維培養條件下發生的EMT相比，同種細胞在三維培養條件下發生EMT時表現出偏向于上皮形態，即更高的E-cadherin 和更低的vimentin表達，并且具有類似腫瘤干細胞的特性，這種特性是二維培養細胞不具備的［10］。

Figure 6.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced epithelial-mesenchymal transformation and activation of PI3K/AKT/mTOR pathway in three-dimensionally cultured 95D cells.Mean±SD. n=4.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TGF-β1 group.圖6 LY294002和rapamycin逆轉TGF-β1誘導的三維培養95D細胞上皮-間充質轉化及PI3K/AKT/mTOR 通路活化

三維培養條件下構建EMT 模型的報道極少，主要受培養方法、生物材料和細胞本身對三維環境及誘導因子敏感性等因素的影響，因此構建EMT 模型較難。例如Pal 等［11］觀察不同生物材料對腫瘤細胞EMT 的誘導作用，結果顯示細胞接種在聚乳酸-乙醇酸［poly（lactic-co-glycolic acid），PLGA］和明膠甲基丙烯酰胺（gelatin methacrylamide，GelMA）混合材料支架后，相比單用這兩種材料更易誘導細胞發生EMT。Essid等［12］采用無血清懸浮培養方法獲得腫瘤細胞球，再用EGF 和FGF 等細胞因子和低氧條件誘導頭頸部鱗癌細胞發生EMT，而常氧和正常血清條件可逆轉EMT 過程。然而上述實驗方法構建EMT模型耗時較長，需3～14 d，過程也較為繁瑣，此外上述研究多集中在細胞表型、蛋白表達，對功能及相關信號通路的研究較少。本研究期望采用一種快速、簡便的方法構建體外肺癌三維EMT 模型，并對其表型、蛋白表達以及功能、信號通路進行研究。我們前期在3D 打印支架上培養肺癌95D 細胞可快速構建體外肺癌三維模型［5］，可在該研究基礎上進一步探索EMT及藥敏的分子機制。

Figure 7.LY294002 and rapamycin reversed TGF-β1-induced resistance to cisplatin in three-dimensionally cultured 95D cells.A：the cell viability was detected by MTT assay；B：the IC50 values of each group.Mean±SD. n=5.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs TGF-β1 group.圖7 LY294002和rapamycin逆轉TGF-β1誘導的三維培養肺癌95D細胞順鉑抗性

我們前期的預實驗表明，95D 細胞在二維培養條件下，對TGF-β1 刺激無反應，但在三維培養條件下有明顯反應，12 h 即可觀察到細胞球離散現象，這表明三維環境可改變細胞的生物學行為。在加入TGF-β1 刺激 3 d 后，三維培養 95D 細胞球出現了明顯的塌陷，細胞球中的細胞發生離散、遷移。電鏡檢測，加入TGF-β1 刺激后，細胞球底部的細胞生長出偽足，并向周圍遷移。進一步用Western blot 驗證顯示，TGF-β1 刺激后的三維培養95D 細胞出現了E-cadherin 下調，N-cadherin 和 vimentin 上調，表明確實發生了EMT，與激光共聚焦觀察到的結果基本一致。

既往研究表明，PI3K/AKT/mTOR 信號通路與腫瘤EMT 及耐藥密切相關［13］，但在三維培養條件下是否有影響需進一步探究。本實驗結果顯示，與對照組相比，EMT組的p-AKT和p-mTOR蛋白表達顯著高于對照組，而加入PI3K及mTOR抑制劑后，p-AKT、pmTOR 蛋白表達較EMT明顯下降，并且EMT被逆轉，表現為 E-cadherin 上調，N-cadherin 和 vimentin 下調，細胞球未出現細胞離散現象。這表明TGF-β1 誘導三維培養肺癌細胞發生EMT 可能是通過激活PI3K/AKT/mTOR 信號通路實現的。MTT 結果顯示，發生EMT 的三維培養95D 細胞對順鉑的敏感性顯著低于對照組，而加入PI3K及mTOR抑制劑后，可重新增強三維培養95D 細胞對順鉑的敏感性，進一步凸顯了PI3K/AKT/mTOR 信號通路在三維培養細胞對藥物抵抗機制中的作用。

綜上所述，本研究在3D 打印技術構建體外肺癌三維模型基礎上利用TGF-β1 成功將其誘導為EMT模型，該方法具有簡單、快速成型、條件可控等特點，并且發現三維培養肺癌細胞發生EMT及對順鉑抵抗可能是通過PI3K/AKT/mTOR 信號通路實現的。這一新型的體外腫瘤模型可為腫瘤轉移和藥敏研究提供有力工具。