基于Nrf2通路探討阿里紅三萜酸減輕脂多糖誘導的小鼠急性肺損傷的作用*

古麗尼歌爾·阿布都米吉提， 沙依拜·沙比提， 叢媛媛， 帕麗達·阿不力孜

（新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊830011）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）以彌漫性肺泡肺間質水腫，難治性低氧血癥及非心源性肺水腫為特征［1-2］，與體內氧化應激（oxidative stress，OS）及炎癥介質升高具有關聯性［3］。氧化應激在體內產生大量的活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），可引起氣道和血管重塑、侵襲肺間質導致肺水腫、對肺實質細胞造成氧化損傷等［4］。研究證實，氧化應激損傷主要建立在ALI 的發生發展過程中［5］。轉錄因子核因子E2 相關因子2（nuclear factor E2-related factor-2，Nrf2）信號通路是一條保護性轉導通路，保護機體抵抗外界氧化應激反應［6］。未受刺激時，Nrf2與Kelch 樣環氧氯丙胺相關蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-related protein 1，Keap1）存在細胞質中，當Nrf2受到氧化應激時則與Keap1解離，Nrf2立即進入細胞核，與抗氧化反應元件結合，激活下游基因如抗氧化酶及Ⅱ相激酶的轉錄，進而表達一系列相關蛋白如血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）等，發揮抗炎和抗氧化作用［7］。

阿里紅為多孔菌科層孔菌屬植物苦白蹄的子實體，具有止咳平喘、祛風利濕、消腫止痛的功效，民間常用于治療肺炎、慢性支氣管炎等疾病［8］。研究顯示，阿里紅的主成分之一三萜酸具有抗炎和抗氧化等藥理作用［9］，但其是否對ALI具有保護作用鮮少見到報道。因此，本研究通過構建LPS誘導的ALI小鼠模型，探討FOTa對ALI的作用及機制。

材 料 和 方 法

1 動物

60 只 SPF 級雄性昆明小鼠，6～8 周齡，體重為（20±2）g，購于新疆醫科大學動物實驗中心，動物生產許可證號：SYXK（新）2018-0003，小鼠飼養于SPF級屏障環境，在室溫（20～25℃）和濕度40%～60%的環境下自由攝食飲水。

2 主要試劑

阿里紅藥材購于自治區維吾爾醫院，由新疆醫科大學藥學院天藥/生藥教研室帕麗達·阿不力孜教授鑒定為阿里紅（Fomes OfficinalsAmes）。地塞米松（dexamethasone，Dex）購自北京索萊寶科技有限公司；脂多糖（lipopolysoccharide，LPS）購自sigma；小鼠丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）ELISA 試劑盒購自上海鈺博生物科技有限公司；血氣片購自IDEXX；逆轉錄試劑盒購自賽默飛世爾科技有限公司；TaKaRa試劑盒購自大連寶生物工程有限公司；兔源Keap1、兔源Nrf2 和兔源HO-1 抗體購自Abcam；兔源β-actin購自北京博奧森生物技術有限公司；辣根過氧化物標記的山羊抗兔IgG 購自中杉金橋生物技術有限公司；Keap1、Nrf2、HO-1 和β-actin 所用引物由上海生物工程有限公司根據設計合成，序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3 主要方法

3.1 FOTa 的提取及含量測定 根據參考文獻［10］精密稱定阿里紅生藥材粗粉（30 目）約220 g，置圓底燒瓶中，加入95%乙醇2.2 L，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用乙醇補足減失的重量，過濾，即得。采用紫外-分光光度法進行FOTa 的含量測定，即Y＝32.848X+0.0496，R＝0.9992，含量為33.5%，得率為15.9%。給藥前，按照阿里紅藥材成人給藥劑量［11］與折算系數 W 計算出 70 mg/kg、140 mg/kg 和280 mg/kg 3 個劑量，用氯化鈉注射液各配成相應濃度的溶液。

3.2 動物分組及處理 將60 只雄性昆明小鼠按隨機數表法分為6 組：對照（control）組、模型［12］組（LPS 5 mg/kg 組）、地塞米松［12］組（Dex 1 mg/kg 組）及FOTa 70 mg/kg、140 mg/kg和280 mg/kg 組，每組10只。FOTa 干預組連續灌胃相應濃度FOTa 4 周，其余組灌胃同等體積生理鹽水，末次灌胃生理鹽水后，Dex 組腹腔注射1 mg/kg，30 min后除對照組外，其余各組腹腔注射5 mg/kg LPS 進行造模。造模成功條件以處理動物當天PaO2/FiO2值與造模前后體重變化值來確定，即 PaO2：FiO2＜300 mmHg 與造模后體重驟降作為成功標志。造模后10 h，取血，脫頸處死小鼠，取左下肺葉檢測肺濕/干重比值（wet/dry weight ratio，W/D），取左上肺葉放于4%多聚甲醛中固定用于病理切片，取右肺組織放置于-80℃儲存備用。

3.3 小鼠血氧分壓、二氧化碳分壓及氧合指數分析 小鼠模型建立10 h 后，取小鼠腹主動脈血液標本行血氣分析［2］。

3.4 肺組織W/D 檢測 用濾紙輕輕吸干肺組織表面水分并置于稱量瓶中精密稱取濕重，在80 ℃干燥箱內烘烤48 h，精密稱取干肺重量并按照C=W濕/W干計算肺組織的濕干重比。

3.5 試劑盒檢測血清中氧化應激指標MDA、SOD和GSH-Px 含量 取血，在4 ℃，1006 ×g的條件下分離血清，按照ELISA 方法，實驗中設置空白對照孔和標準品孔，采用說明書進行規范加樣，最后選擇450 nm波長檢測A值，并根據標準品的吸光度值及相應的濃度值，制作標準曲線，根據標準曲線計算出待測樣品的濃度值。

3.6 HE 染色觀察肺組織病理學變化 將肺組織置于4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋，切成約5 μm 厚的薄片之后用二甲苯脫蠟，經梯度乙醇脫水置換。按照標準程序進行蘇木精-伊紅染色，清洗、脫水、封片，于400 倍光學顯微鏡下觀察組織病理學改變。分別以肺泡水腫、肺泡內充血、肺泡內充血、肺間質水腫程度評分：無改變或非常輕微為0 分，輕度改變為1 分，中度改變為2 分，重度改變為3 分，極重度改變為4 分，累計上述4 項的平均分值即為肺損傷評分［13］。

3.7 RT-qPCR 檢測肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1 的mRNA 表達量 肺組織用Trizol 法提取總RNA，按照試劑盒操作說明將RNA 逆轉錄為cDNA，RT-qPCR擴增條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 31 s，40 個循環。用目的基因的Ct 值減去內參照的Ct 值，得出ΔCt 值，然后用待測組分的ΔCt 值減去正常組的ΔCt值，得出 ΔΔCt 值，采用 2-ΔΔCt分析方法分析目的基因表達量。

3.8 Western blot 檢測肺組織中 Nrf2、Keap1 及 HO-1的蛋白表達量 取50～100 mg 肺組織在液氮中進行研磨，并立刻放入RIPA 緩沖液中，待組織與緩沖液充分反應后，離心取上清，用BCA 法進行蛋白定量，每孔等量加樣，依次進行SDS-PAGE，轉膜，5%脫脂奶粉溶液封閉，洗膜并依次加入到Keap1、Nrf2、HO-1（1：1000）和β-actin Ⅰ抗（1∶5 000），4℃孵育過夜。次日洗膜，加入Ⅱ抗（1∶10 000）室溫孵育60 min，洗膜，用增強化學發光（ECL）檢測試劑盒顯影。用ImageJ圖像分析方法進行灰度值分析。

4 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計軟件進行統計學分析。數據結果均采用均數±標準差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析結合多組間方差分析，以P＜0.05 為差異具有統計學意義。

結 果

1 FOTa 對ALI 小鼠血氧分壓、二氧化碳分壓及氧合指數影響

與對照組相比，模型組PaO2與PaO2/FiO2降低（P ＜0.05），PaCO2升高（P ＜0.05）；與模型組相比，FOTa-280 mg/kg 組 及 Dex 組 PaO2與 PaO2/FiO2升 高（P ＜0.05），PaCO2降低（P ＜0.05），見圖1。

2 FOTa對ALI小鼠肺組織W/D的影響

與對照組相比，模型組的W/D 升高（P ＜0.05）；與模型組相比，FOTa-280 mg/kg組及Dex組的W/D降低（P ＜0.05），見圖2。

3 FOTa 對小鼠血清中 MDA、SOD 和 GSH-Px 水平的影響

與對照組比較，模型組小鼠的MDA 水平升高（P ＜0.05），SOD 及 GSH-Px 水平降低（P ＜0.05）；與模型組比較，FOTa 280 mg/kg 組及Dex 組均能降低血清中 MDA 水平（P＜0.05），升高 SOD 及GSH-Px 水平（P＜0.05），見圖3。

4 FOTa對小鼠肺組織病理學的影響

結果顯示，對照組肺組織結構清晰，肺泡結構未見明顯異常；模型組肺泡腔和間質可見大量紅細胞滲出，并伴有肺間質水腫、肺泡結構被破壞、肉眼見片狀血灶；FOTa-280 mg/kg組及Dex組肺組織紅細胞浸潤明顯減少，肺泡結構有所改善，肺間質水腫減輕，片狀血灶明顯減少，與對照組相比，模型組肺組織損傷評分升高（P＜0.05）。與模型組相比，FOTa-280 mg/kg 組及Dex 組肺組織損傷評分降低（P＜0.05），見圖4、5。

Figure 1.The effect of FOTa on indexes of arterial blood gas analysis in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖1 FOTa對ALI小鼠動脈血中血氣分析相關指標的影響

Figure 2.The effect of FOTa on the wet-to-dry weight ratio（W/D）of the lung tissue in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖2 FOTa對ALI小鼠肺組織濕干重比例的影響

5 FOTa 對 ALI 小鼠肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1 mRNA表達量的影響

與對照組相比，模型組Keap1 mRNA 表達水平升高（P＜0.05），Nrf2 與 HO-1 mRNA 表達水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，FOTa-280 mg/kg 組及Dex組 Keap1 mRNA 表達水平降低（P＜0.01），Nrf2 與HO-1 mRNA表達水平升高（P＜0.05），見圖6。

Figure 3.The effect of FOTa on the oxidative stress（serum MDA，SOD and GSH-Px levels）in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖3 FOTa對ALI小鼠血清中氧化應激水平的影響

Figure 4.Effect of FOTa on the histopathological changes of the lung tissue in ALI mice（HE staining，scale bar=50 μm）.圖4 FOTa對ALI小鼠肺組織病理學改變的影響

Figure 5.Effect of FOTa on the lung injury score of the lung tissue in ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖5 FOTa對ALI小鼠肺組織損傷評分的影響

6 FOTa 對 ALI 小鼠肺組織 Nrf2、Keap1 及 HO-1蛋白表達的影響

與對照組相比，模型組Keap1 蛋白表達水平升高（P＜0.05），Nrf2 與HO-1 蛋白表達水平降低（P＜0.05）；與模型組相比，FOTa 低、中、高劑量組及Dex組 Keap1 蛋白表達水平均降低（P＜0.05），Nrf2 和HO-1蛋白水平升高（P＜0.05），見圖7。

討 論

ALI 以發病機制繁瑣，病情進展迅猛為特點，被稱為臨床常見的危急重疾病之一［14］。研究顯示，革蘭陰性細菌感染引發膿毒癥是ALI 的主要原因［15］，也因此而引發肺部炎癥細胞的招募和浸潤［16］。外膜是革蘭陰性細菌細胞壁的主要致病因素，而脂多糖正是存在于外膜的內毒素主成分［17］，它在很大程度上可以模擬膿毒癥和ALI。在動物模型中，因為氣管注射可能伴有嚴重出血和壞死的可能性，因此通過腹腔注射以誘發 ALI［18］。

Figure 6.Effects of FOTa on the mRNA expression of Keap1，Nrf2 and HO-1 in the lung tissue of ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖6 FOTa對ALI小鼠肺組織Keap1，Nrf2及HO-1 mRNA表達的影響

Figure 7.Effect of FOTa on the Keap1，Nrf2 and HO-1 protein expression in the lung tissue of ALI mice.Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs LPS group.圖7 FOTa對ALI小鼠肺組織中Keap1、Nrf2及HO-1蛋白表達的影響

本實驗中，W/D 升高及病理切片中大量紅細胞滲出、片狀血灶，可視為LPS 成功誘發了炎癥反應。根據柏林定義［2］，將 PaO2：FiO2＜300 mmHg 稱作為ALI。本實驗血氣指標顯示，模型組小鼠PaO2：FiO2＜300 mmHg（PaO2/FiO2≈250，FiO2=0.21），PaCO2升高。而動脈血中PaCO2的升高嚴重影響了機體的換氣功能。綜合上述結果，該實驗建立模型成功。給藥組中，PaCO2明顯降低說明機體換氣功能有所改善。FOTa 對PaCO2的升高有了明顯緩解作用，這可能是FOTa 抑制了肺部炎癥反應，提高了血氧結合比，從而改善了肺部功能。

在LPS 誘導下，炎癥細胞可通過浸潤肺組織引發炎癥因子聚集而誘發氧化應激反應［19］，外源性和內源性ROS介導的氧化應激是引發炎癥介質和細胞損傷的重要因素［20］，其中，SOD 與 GSH-Px 兩種酶在肺組織內源性抗氧化系統中起重要作用，而MDA 作為自由基脂質過氧化反應的最終產物，反映肺組織的損傷程度［21］。ELISA 法顯示，模型組血清中 SOD與GSH-Px 濃度降低，此結果可能與LPS 引發的肺部氧化應激有關，而MDA 濃度升高也證明了這一結果。FOTa 的應用降低了MDA，升高了SOD 與GSHPx 的水平，從而阻止了氧化應激對正常肺組織細胞的損傷，降低了肺組織炎癥細胞及紅細胞浸潤。

Nrf2 介導的信號通路是機體內維持氧化應激的重要信號通路。此外，研究表明Keap1 是氧化應激的關鍵傳感器［22］。經LPS刺激，模型組中Keap1蛋白表達水平升高，此結果表明Keap1 參與了氧化應激反應的誘發。接著，在氧化脅迫下Nrf2 從Keap1 中釋放出來，從而激活其在核中下游調控的基因—HO-1［23］。研究顯示，HO-1 具有較強的抗炎作用［24］。根據本實驗FOTa 增加HO-1 mRNA 及蛋白表達水平的結果推測FOTa 與HO-1 共同協調了抗炎作用。而Nrf2 通過調節抗氧化應激反應蛋白的功能來維持細胞穩態［24］。研究顯示，Nrf2 未激活時體內的氧化應激反應水平極高，也是ALI 發展迅猛的時期［25］。給藥組中FOTa 升高了Nrf2 的蛋白表達水平，表明當藥物發揮保護作用時，Nrf2 是以激活的狀態存在體內的。綜上所述，Nrf2 信號通路參與了FOTa 減輕LPS誘導的小鼠ALI的病理生理過程。