大氣顆粒物急性暴露對C57BL/6小鼠肺臟病理改變和氣道上皮細胞IL-6和IL-8表達的影響*

王 強， 董 年

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，浙江溫州325000）

伴隨著不斷推進的工業(yè)化、城市化的進程，日益嚴重的空氣污染是我國目前嚴重危害健康的公共衛(wèi)生問題［1］。大氣顆粒物（particulate matter，PM）是空氣污染物中的重要成分，根據(jù)空氣動力學直徑又可劃分為粗顆粒物（PM10）、細顆粒物（PM2.5）和超細顆粒物（PM0.1）。PM 可以隨呼吸運動廣泛沉積在肺臟，與肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［2-3］。氣道上皮是PM 進入肺臟后的第一道防線，目前認識到氣道上皮不僅是肺臟結(jié)構(gòu)細胞，而且扮演了啟動細胞和繼發(fā)受體的角色［4-5］。受限于難以直接獲取PM 急性暴露的人體肺臟標本，目前PM 暴露氣道炎癥反應的分子機制尚未完全闡明。本研究擬采用PM 急性暴露的小鼠模型，觀察肺臟的病理改變和炎癥介質(zhì)白細胞介素6（interlukin-6，IL-6）和白細胞介素8（interlukin-8，IL-8）的分泌。已知IL-6 和 IL-8 是常見的趨化因子，具有趨化中性粒細胞、級聯(lián)擴大炎癥反應、引發(fā)肺部疾病的作用［6-7］。不同于既往主要聚焦免疫細胞來源的IL-6 和IL-8，本研究擬在小鼠肺臟病理改變的基礎上，采取肺臟固有結(jié)構(gòu)細胞氣道上皮細胞來研究PM誘導IL-6和IL-8的分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

6～8 周 SPF 級雄性 C57BL/6 小鼠（20～22 g）購自北京維通利華實驗動物技術公司，許可證號為SXCK（京）2016-0011。人正常氣道上皮細胞系BEAS-2B購自上海中科院細胞庫。PM 購自NIST；RPMI-1640培養(yǎng)液和胎牛血清購自Gibco；兔抗人p-Akt和Akt抗體購自 CST；兔抗人 GAPDH 抗體購自 Santa Cruz；PI3K抑制劑LY294002 購自Sigma；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白Marker和ECL發(fā)光液購自Thermo。

2 方法

2.1 動 物 模 型 選 取 20 只 6～8 周 SPF 級 雄 性C57BL/6 小鼠（20～22 g），均腹腔注射 10 mL/kg 的水合氯醛麻醉，隨機分為 2 組（n=10）：（1）空白對照（vehicle）組：PBS 25 μL 氣道滴注，連續(xù)氣道滴注2 d；（2）PM 實驗組：4 g/L PM 懸浮液25 μL 氣道滴注，連續(xù)氣道滴注2 d。空白對照組和PM 實驗組在末次氣道滴注24 h 后處死小鼠獲取動物標本進行后續(xù)實驗。

2.2 細胞模型 BEAS-2B 細胞使用含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640 培養(yǎng)液，置于37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。使用0.25%胰酶溶液進行消化傳代，獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期細胞。具體實驗分組如下：（1）200 mg/L 的PM 刺激 BEAS-2B 細胞 3、6、12 和 24 h，檢測 IL-6 和 IL-8 的mRNA 變化；（2）25、50、100、200 和 400 mg/L 的 PM刺激 BEAS-2B 細胞 24 h，檢測 IL-6 和 IL-8 的蛋白變化；（3）200 mg/L 的 PM 刺激 BESA-2B 細胞 5、10 和15 min，檢測PI3K 信號通路相關蛋白的變化；（4）預先給予 5 μmol/L PI3K 抑制劑 LY294002 干預 0.5 h，200 mg/L 的 PM 刺激 BESA-2B 細胞 15 min，檢測 PI3K信號通路相關蛋白的變化。

2.3 ELISA 實驗 獲取小鼠支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）或細胞培養(yǎng)上清，4℃、1 000 r/min 離心后獲取上清液，ELISA 板中添加標準品和檢測樣品，37℃培養(yǎng)箱孵育2 h后移除ELISA 板每孔中的液體，添加100 μL 的生物素抗體在37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，再次洗滌去液體添加HRP-抗生物素蛋白，37℃培養(yǎng)箱孵育1 h，重復洗滌過程5次，然后顯色和終止，利用酶標儀計算每孔吸光度（A）值，根據(jù)標準曲線計算每孔檢測樣品的濃度。

2.4 Western blot 實驗 獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的BEAS-2B 細胞，不同實驗干預之后獲取細胞，細胞裂解液裂解細胞，4℃、20 913×g離心10 min提取上清液，使用BCA 測定蛋白濃度。兩組細胞分別取 30 μg 蛋白進行 SDS-PAGE，濕轉(zhuǎn)至 PVDF 膜，5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h，Ⅰ抗（1∶1 000）4℃孵育過夜，TBST 緩沖液洗膜10 min×3 次，Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育 1.5 h，再用 TBST 緩沖液洗膜 10 min×3 次，化學發(fā)光法顯影條帶。

2.5 real-time PCR 實驗 獲取生長狀況良好的對數(shù)生長期的BEAS-2B 細胞，不同實驗干預之后獲取細胞，按照Trizol 說明書提取細胞總RNA，分光光度法測定提取的總RNA 濃度。取總RNA 2 μg 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以適量cDNA 為模板進行Real-time PCR實驗。反應條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，總共 40 個循環(huán)。以 GAPDH 為內(nèi)參照，數(shù)據(jù)以 2-ΔΔCt計算。引物序列見表1。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

2.6 HE 染色、過碘酸-希夫（periodic acid-Schiff，PAS）染色及病理分級 造模成功之后處死動物，經(jīng)氣管插管灌注多聚甲醛填充肺臟，獲取完整的肺臟置于多聚甲醛中固定，隨后進行石蠟包埋，獲得肺組織切片。（1）HE染色：切片依次使用二甲苯Ⅰ、Ⅱ，乙醇行脫蠟、水化處理后，蘇木素染液中浸泡染色，分別浸泡在鹽酸酒精，PBS 中分化、反藍，使用用伊紅染色后脫水封片。（2）PAS 染色：切片脫蠟水化并用高碘酸酒精溶液浸泡，置雪夫染液中室溫染色用亞硫酸溶液，蒸餾水沖洗待干，用甲綠復染，鹽酸酒精分化后脫水封片。（3）病理分級：在光學顯微鏡下評分，以0～3 的主觀等級評估支氣管周圍和血管周圍的炎癥程度［0 分：未觀察到炎癥時；1 分：偶見炎癥細胞；2 分：氣道或血管周圍不均勻分布的炎癥細胞或炎癥細胞圍繞成薄的環(huán)狀（層厚1～5 個炎癥細胞）；3 分：氣道或血管周圍分布均勻的炎癥細胞或炎癥細胞圍繞成厚的環(huán)狀（層厚＞5個炎癥細胞）］［8］。

3 統(tǒng)計學處理

使用SPSS 20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），組間兩兩比較采用 Bonferroni 校正的t檢驗。以P＜0.05 為差異存在統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 氣道滴注PM 可誘導C57BL/6 小鼠以氣道炎癥為主的肺組織病理改變和BALF 中IL-6 和IL-8 的分泌

針對C57BL/6 小鼠肺組織進行病理分級評分，PM 實驗組小鼠肺組織氣道周圍炎癥細胞浸潤，氣道上皮細胞變厚，伴隨PM 在氣道內(nèi)的沉積，PM 實驗組PAS 染色陽性，病理分級顯著升高（P＜0.01），見圖1A、B。ELISA 結(jié)果顯示，PM 實驗組 C57BL/6 小鼠BALF 中炎癥介質(zhì)IL-6和IL-8顯著升高（P＜0.01），見圖1C、D。

2 PM 刺激可誘導氣道上皮細胞中IL-6 和IL-8 mRNA和蛋白水平的變化

使用 200 mg/L 的 PM 刺激 BEAS-2B 細胞 3、6、12和24 h，real-time PCR 顯示該細胞中IL-6 和IL-8 mRNA 水平升高，在3 h 達到高峰（P＜0.01），之后呈時間依賴性降低，見圖2A、B。使用25、50、100、200和 400 mg/L 的 PM 刺激 BEAS-2B 細胞 24 h，ELISA 結(jié)果顯示IL-6 和IL-8 分泌水平顯著升高，在200 mg/L PM 刺激下達到高峰（P＜0.01），在25～200 mg/L 之間呈濃度依賴性升高，見圖2C、D。

3 PM 刺激對氣道上皮細胞PI3K 信號通路的活化和PI3K抑制劑在其中的阻斷作用

使用 200 mg/L 的 PM 刺激 BESA-2B 細胞 5、10 和15 min，Western blot 結(jié)果顯示，PM 可誘導 Akt 蛋白磷酸化水平顯著升高，且呈現(xiàn)時間依賴性，在15 min達到最高（P＜0.01），見圖3A。預先給予PI3K 抑制劑干預，Western blot 結(jié)果顯示，PM+LY294002 組p-Akt蛋白水平較PM組顯著降低（P＜0.05），見圖3B。

4 抑制PI3K 信號通路可部分逆轉(zhuǎn)PM 誘導的氣道上皮細胞IL-6和IL-8分泌

預先給予PI3K 抑制劑LY294002 干預，然后使用 200 mg/L PM 刺激 BEAS-2B 細胞 24 h，ELISA 結(jié)果顯示，PI3K 抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)PM 誘導的IL-6 和IL-8 分泌，PM+LY294002 組 IL-6 和 IL-8 的分泌水平較PM組顯著降低（P＜0.01），見圖4。

討 論

空氣污染是我國目前嚴重危害健康的公共衛(wèi)生問題，作為空氣污染物中固態(tài)顆粒狀物質(zhì)和液態(tài)顆粒狀物質(zhì)的總稱，大氣PM 是近年來公共衛(wèi)生與預防醫(yī)學的研究熱點［9］。呼吸系統(tǒng)是PM 進入機體的主要途徑，由于粒徑小、重量輕和比表面積大，PM可以隨呼吸氣流廣泛沉積于氣道或肺泡［10］。流行病學調(diào)查揭示，PM 暴露與慢性氣道疾病、肺惡性腫瘤等肺部疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關［11］。既往研究過多聚焦PM 持續(xù)暴露下的氣道重構(gòu)或腫瘤惡性轉(zhuǎn)化［12］，針對PM 急性暴露下肺臟病理生理變化的研究相對缺乏。考慮到PM 急性暴露下肺臟病理生理變化可能存在一定的可逆性，深入研究PM 急性暴露下肺臟的病理變化以尋找潛在的防治靶點具有重要意義。由于臨床上難以獲得PM 急性暴露的人體肺臟標本，本研究采取PM 連續(xù)2 d氣道滴注的體內(nèi)模型以模擬臨床上PM 急性暴露，獲取小鼠肺臟組織進行HE 染色和PAS 染色，結(jié)果顯示肺臟組織以氣道炎癥為主，具體病理改變包括氣道PM 沉積、炎癥細胞浸潤和糖原染色陽性，而并未觀察到氣道的結(jié)構(gòu)性改變，與Xu等［10］報道的相似。與此同時，針對 C57BL/6 小鼠BALF 中炎癥介質(zhì)IL-6 和IL-8 的檢測，結(jié)果顯示BALF 中 IL-6 和 IL-8 分泌水平升高。已知 IL-6 和 IL-8是重要的炎癥介質(zhì)，可調(diào)控中性粒細胞等炎癥細胞的募集和活化，在炎癥級聯(lián)擴大反應中發(fā)揮重要作用。既往研究認為，在炎癥反應中IL-6 和IL-8 主要來源于血液單核-巨噬細胞系統(tǒng)［13］。目前逐漸認識到氣道上皮細胞在氣道炎癥中扮演啟動細胞和繼發(fā)受體的角色，而IL-6 和IL-8 同樣可以由氣道上皮細胞分泌并參與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展。考慮到動物模型中PM 急性暴露主要導致氣道炎癥為主，沒有明顯的肺泡損傷，本研究在細胞模型中采取了人氣道上皮細胞，以在體外實驗中更深層次研究氣道上皮細胞的炎癥改變。結(jié)果顯示，PM刺激氣道上皮細胞可以誘導IL-6 和IL-8 的分泌表達，我們推測來自氣道上皮的IL-6 和IL-8 以旁分泌的形式招募血液中的中性粒細胞等炎癥細胞參與氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展。考慮到PM 急性暴露下氣道炎癥尚未發(fā)生氣道重構(gòu)等變化，炎癥損傷具有一定的可逆性，深入研究其中的分子機制和尋找其中的關鍵靶點可為PM 誘導氣道炎癥的防治提供參考資料。

Figure 1.Effect of PM exposure on the lungs of C57BL/6 mice.The C57BL/6 mice model was established by intratracheal instillation of PM for 2 consecutive days.A：representative images of lung sections with PAS staining；B：the inflammation scores for images of lung sections；C，D：the levels of IL-6 and IL-8 in the BALF measured by ELISA.Mean±SD. n=10.*P＜0.05，**P＜0.01 vs vehicle group.圖1 氣道滴注PM可誘導C57BL/6小鼠以氣道炎癥為主的肺組織病理改變和BALF中IL-6和IL-8的分泌

Figure 2.PM exposure up-regulated the expression of IL-6 and IL-8.A，B：the relative mRNA levels of IL-6 and IL-8 in the BEAS-2B cells treated with 200 mg/L PM for 3，6，12 and 24 h；C，D：the concentrations of IL-6 and IL-8 in the culture supernatants of the BEAS-2B cells treated with 25，50，100，200 and 400 mg/L PM for 24 h.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs 0 h or 0 mg/L group.圖2 PM刺激可誘導氣道上皮細胞IL-6和IL-8 mRNA和蛋白水平的變化

Figure 3.PM exposure induced phosphorylation of PI3K/Akt signaling pathway.A：the protein levels of p-Akt and Akt in the BEAS-2B cells exposed to PM（200 mg/L）for indicated time were measured by Western blot；B：the protein levels of p-Akt and Akt in the BEAS-2B cells exposed to PM with or without PI3K inhibitor LY294002 were measured by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs 0 min or vehicle（no treatment）group；#P＜0.05 vs PM group.圖3 PM刺激對氣道上皮細胞PI3K信號通路的活化和PI3K抑制劑在其中的阻斷作用

Figure 4.PI3K inhibitor partially reversed the secretion of IL-6（A）and IL-8（B）in the BEAS-2B cells induced by PM.The BEAS-2B cells were pretreated with LY294002，and were subsequently exposed to PM for 24 h.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs vehicle（no treatment）group；##P＜0.01 vs PM group.圖4 PI3K抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)PM誘導的氣道上皮細胞IL-6和IL-8分泌

已知PI3K 信號通路與細胞增殖凋亡、炎癥反應、腫瘤惡性轉(zhuǎn)化等密切相關，同時PI3K 信號通路的活化在肺部疾病的炎癥細胞聚集、炎癥介質(zhì)釋放和氣血屏障破壞中具有重要作用［14-15］。本研究的細胞實驗結(jié)果顯示，PI3K 抑制劑可部分逆轉(zhuǎn)PM 誘導的氣道上皮細胞IL-6 和IL-8 分泌；與此同時，PM 可以誘導氣道上皮細胞PI3K 信號通路的活化。以上結(jié)果表明，PI3K 信號通路在誘導炎癥介質(zhì)的分泌上發(fā)揮調(diào)控作用，與報道的PI3K 信號通路參與調(diào)控PM 誘導的 COX-2/PGE2表達相似［16］。相較于 PI3K 信號通路，文獻報道ERK 和P38等同樣介導了PM 誘導的氣道上皮細胞炎癥介質(zhì)的分泌過程［17］，圍繞PI3K、ERK、P38等信號通路之間的聯(lián)系是后續(xù)的重點研究方向。

本研究尚存較多的不足之處：首先，體內(nèi)實驗中使用PM 氣道滴注的方法雖然目前被廣泛使用，然而PM 氣道滴注不能完全反映PM 吸入的病理生理過程，后續(xù)的研究中我們正在嘗試進行PM 霧化吸入的方法；其次，體外實驗中僅僅選取了一個永生化的氣道上皮細胞株BEAS-2B，如能分離原代氣道上皮細胞則更能反映體內(nèi)的真實情況；最后，在信號轉(zhuǎn)導方面，我們僅僅是證明了PI3K 信號轉(zhuǎn)導在其中的調(diào)控作用，針對PM 如何調(diào)控PI3K 信號轉(zhuǎn)導的活化并未深入涉及，以及沒有深入驗證PI3K 抑制劑在體內(nèi)實驗中的效果。

綜上所述，本研究的動物實驗揭示了PM 急性暴露下肺臟以氣道炎癥為主的病理改變，而體外細胞實驗揭示了PI3K 信號通路介導PM 誘導氣道上皮細胞IL-6 和IL-8 的分泌。本研究從動物和細胞兩個層次模擬人群在PM 急性暴露下肺臟的病理生理改變，為闡明PM 誘導氣道炎癥的分子機制進行了初步的探索。