撫仙湖超微型浮游藻類群落結構空間分布特征

吳 凡,任名棟,陳非洲,吳慶龍,史小麗,*

1 中國科學院南京地理與湖泊研究所,南京 210008 2 中國科學院大學,北京 100049

撫仙湖位于云南省中部,北緯24°21′28″—24°38′00″,東經102°49′12″— 102°57′26″之間[1],呈主軸南北向的倒掛葫蘆型,跨澄江、江川和華寧三縣。湖泊面積211 km2,平均水深87.0 m,最大水深達157.3 m,是僅次于長白山天池的中國第二大深水湖泊。撫仙湖蓄水量占云南9大高原湖泊的72.8%,占全國淡水湖泊的9.16%,是我國重要的淡水資源[2]。撫仙湖為半封閉的山間盆地型湖泊,湖水主要靠降水和山間小河匯集補充[3],水質清澈,為貧營養湖泊[4]。近年來由于人類活動的影響[5],撫仙湖水質不斷發生變化,污染物濃度增加,營養水平提高,水體透明度下降,水質達I類水的面積占全湖的比例不斷下降[6]。

超微型浮游藻類(autotrophic picophytoplankton,APP)是指粒徑在0.2—3 μm的微型藻類,包括超微真核藻(photosynthetic picoeukaryotes,PPEs)和超微藍藻(picocyanobacteria,PCY)[7],廣泛分布于海洋和淡水生態系統中,是水生生態系統中重要的初級生產者[8- 10],尤其是在貧營養湖泊中,是主要的碳源固定者[11]。由于超微藻粒徑較小,受傳統研究方法的限制,對其的認知還非常有限。近年來,隨著流式細胞術和分子生物學技術的廣泛應用,超微藻的研究方法得到突破性進展,對其關注度也越來越高。國內已有關于超微藻的研究集中在富營養湖泊,周建等研究了大型通江湖泊鄱陽湖超微型浮游藻類的空間分布特征[12]；李勝男等研究了大型富營養化淺水湖泊太湖、巢湖超微真核藻的時空分布特征和主要環境影響因子[13]；史小麗等對長江中下游的20多個中營養型和富營養型湖泊超微真核藻的群落結構進行研究[14]。目前國內關于貧營養湖泊超微藻的認知幾乎是空白[15]。撫仙湖作為山間盆地型貧營養深水湖泊,必然具有不同于富營養化淺水湖泊的超微藻群落結構。超微藻作為貧營養湖泊初級生產力的主要貢獻者,對其組成和分布的研究有助于更全面的認識撫仙湖生態系統結構和功能。本論文結合流式細胞術和高通量測序技術,系統研究了撫仙湖超微藻群落結構組成的空間分布特征及其影響因子。

圖1 撫仙湖采樣點位分布圖(·代表采樣點位) Fig.1 Distribution of sampling sites in Lake Fuxian (·represent sampling sites)P：表層采樣點位；D：垂直采樣點位

1 材料與方法

1.1 采樣地點及處理

2016年7月對撫仙湖進行采樣,共35個采樣點,采取表層0.5 m的水樣,同時對北部和南部(D1、D2)最深點進行分層采樣(圖1)。D1點采集水下0.5 m、20 m、40 m、60 m、100 m、120 m深處的水樣,編號分別為D1_0、D1_20、D1_40、D1_60、D1_100、D1_120；D2點采集水下0.5 m、20 m、40 m、60 m深處的水樣,編號分別為D2_0、D2_20、D2_40、D2_60。選擇表層35個點位的樣品對超微藻豐度水平分布特征分析,選擇南北通透的P31、P32、P33、D1、D2五個點位進行超微真核藻群落結構水平分布分析,選擇北部和南部最深點(D1和D2)分層點位的樣品對超微藻豐度和超微真核藻群落結構的垂直分布特征進行分析。用采水器采集不同深度的湖水,置于用原位湖水潤洗后的白色塑料水桶內,帶回實驗室。部分水樣用25%的戊二醛固定(最終濃度為2%)后,用液氮速凍,帶回實驗室用于后續的流式細胞儀分析。

1.2 參數測定方法

1.2.1水樣理化參數測定

1.2.2流式分析

將戊二醛固定的水樣在常溫下自然解凍,水樣混勻后用300目篩絹過濾(以免較大的顆粒物堵塞流式細胞儀的噴嘴),用流式細胞儀(BD FACSJazz Cytometer,USA)計數超微藻豐度[20]。因超微真核藻富含葉綠素,而超微原核藻富含藻藍素或藻紅素[21],結合熒光信號、前向散射光和側向散射光,通過流式細胞儀區分原核超微藻和真核超微藻,并分別計數和分選。

1.2.3目的片段擴增及測序

用Qiagen公司提供的DNA提取試劑盒DNeasy Blood & Tissue Kit 提取分選的超微真核藻樣品DNA用于目的片段擴增。真核超微藻的擴增引物選擇EK-NSF573 5′-CGC GGT AAT TCC AGC TCC A- 3′和Ek-NSR951 5′-TTG GYR AAT GCT TTC GC- 3′ 。

擴增反應程序為：95 ℃預變性2 min；95 ℃變性20 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸30 s,循環30次；72 ℃延伸10 min。擴增后的產物進行MiSeq上機測序。

1.2.4序列優化及OTU聚類

測序獲得的原始數據,使用Cutadapt軟件去除末尾的引物序列,然后使用fastx去除末尾質量低于Q15的堿基后用FLASH軟件對數據進行合并,得到有效序列。最后丟棄后引物錯配兩個堿基以上的、長度短于200 bp、總堿基錯誤率高于1的序列,得到優化后的序列。最后使用UPARSE軟件將序列按照指定的相似度聚類為OTU(Operational Taxonomic Unit),其中真核樣品的相似度為97%。最后根據Silva123數據庫對聚類后的OTU注釋。

1.2.5數據分析與處理

運用Excel、Origin 8.5、R Studio進行數據分析和圖表的繪制。用ArcGis10.2采用克里格(Kriging)插值法做超微藻豐度的空間分布情況圖。

2 結果

2.1 撫仙湖超微藻對總浮游藻類的貢獻

通過逐級過濾法測定撫仙湖超微藻在總浮游藻類生物量中的貢獻。撫仙湖北部最深點D1超微藻Chla濃度在水下20—30 m之間達到最大值,為0.75 μg/L；南部最深點D2超微藻濃度在水下10 m處達到最大值,為1.25 μg/L。超微藻對總浮游藻類生物量的貢獻率分別在水下50 m和30 m最大,南部最深點貢獻率的平均值約為40%,明顯高于北部最深點。并且受溫躍層等因素的影響,北部最深點超微藻的貢獻率在不同深度波動較大(圖2)。

圖2 撫仙湖超微藻Chla和超微藻對總浮游藻類Chla貢獻率垂直分布Fig.2 The vertical distribution of picophytoplankton Chla concentration and its contribution to total phytoplankton biomass (%) in Lake Fuxian

2.2 撫仙湖超微藻的豐度空間分布特征

2.2.1超微藻豐度的水平分布特征

撫仙湖夏季超微藻平均豐度為(8.58±3.25)×103個/mL,水平空間分布表現為：在撫仙湖北部和南部沿岸帶豐度最高,北部梁王河(P2)豐度最高,為11.91×103個/mL,從北向南豐度逐漸降低,在北部最深點達到最低,豐度為4.82×103個/mL,隨后又逐漸升高,在最南端(P28)豐度達到最高,豐度為10.33×103個/mL。超微真核藻和超微藍藻的豐度空間分布和總超微藻的類似,均表現為：在最北部的斷面(P2)豐度相對北部其他湖區較高,在北部最深點豐度最低,超微真核藻和超微藍藻的豐度分別為1.33×103個/mL和3.49×103個/mL,在最南部斷面(P28)豐度達到最大值,豐度分別為2.14×103個/mL和8.19×103個/mL(圖3)。

圖3 撫仙湖超微藻豐度空間分布Fig.3 The spatial distribution of picophytoplankton abundance in Lake Fuxian

2.2.2超微藻豐度的垂直分布特征

撫仙湖北部最深點D1處水深157.3 m,南部最深點D2處水深78.0 m。流式細胞儀計數的結果表明：北部最深點豐度總體上低于南部最深點。北部D1點不同深度總超微藻豐度的平均值為(7.49±2.18)×103個/mL,超微藍藻和超微真核藻豐度的平均值分別為(5.83±1.97)×103個/mL和(1.66±0.36)×103個/mL。在水下10 m處超微藻豐度達到最大值,隨著深度的增加超微藻豐度有所下降,超微藍藻和超微真核藻的變化趨勢基本一致。南部D2點超微藻豐度的平均值為(11.48±2.67)×103個/mL,超微藍藻和超微真核藻豐度的平均值分別為(9.05±2.06)×103個/mL和(2.42±0.65)×103個/mL。同樣也是在水下10 m處超微藻豐度值最高,隨著深度的增加豐度值逐漸下降,超微真核藻和超微藍藻的變化趨勢也大致相同,但是超微真核藻的豐度大大低于超微藍藻(圖4)。

圖4 撫仙湖超微藍藻和超微真核藻垂直分布Fig.4 The vertical distribution of picophytoplankton in Lake Fuxian

2.3 超微藻豐度和環境因子之間的關系

將表層35個點位的數據和南北部最深點不同深度的數據通過方差膨脹因子(VIF)分析和建模得到超微藻豐度和環境因子之間的相關關系。結果表明：水體濁度、pH以及總磷對超微真核藻豐度有顯著影響,其中濁度與超微真核藻之間的相關性最大；超微藍藻的豐度受總磷影響較顯著,其次是pH(圖5)。

圖5 超微藻豐度和環境因子之間的關系Fig.5 The relationship between the abundance of picophytoplankton and environmental factors

2.4 超微真核藻群落組成

淡水湖泊超微藍藻主要為聚球藻Synechococcus,而超微真核藻多樣性更高,群落結構更為復雜,因此本文主要對超微真核藻的多樣性進行研究。對分選出的超微真核藻樣品進行高通量測序和分析,共獲得88個OTUs,由表1可以看出,撫仙湖超微真核藻中不等鞭毛類的金藻綱(Chrysophyceae)占比最高,達到57.11%,隨后是囊泡蟲門的甲藻綱(Dinophyceae) 和硅鞭藻綱(Dictyochophyceae),硅藻綱(Bacillariophyceae)和綠藻綱(Chlorophyceae)占比相對較少。

表1 撫仙湖超微真核藻的分類特征

2016年7月撫仙湖的測序樣品中,序列豐度最高的前10個OTUs主要分布在不等鞭毛類的金藻綱Chrysophyceae(OTU6、OTU31、OTU183、OTU193、OTU11)、硅鞭藻綱Dictyochophyceae(OTU4、OTU2),甲藻綱Dinophyceae(OTU1、OTU24)以及硅藻綱Bacillariophyceae(OTU42)。但是屬于甲藻綱的2個OTUs以及部分不等鞭毛類尚未確定到屬水平。

將北部最深點、南部最深點不同深度和表層南北通透的5個點位的88個OTUs進行群落組成分析,其中將占比不足1%的物種歸到others類,圖6為超微真核藻群落組成呈現出的空間差異。北部最深點(D1)不同深度的水體有明顯的差異：表層(D1_0)點主要是甲藻綱(Dinophyceae)、金藻綱(Chrysophyceae)和硅鞭藻綱(Dictyochophyceae)；20 m深處(D1_20)主要是金藻綱和硅鞭藻綱,綠藻綱(Chlorophyceae)的占比增加；40 m深處(D1_40)硅鞭藻綱和金藻綱序列豐度增加,綠藻綱序列豐度減少；而在60 m深處(D1_60),綠藻綱豐度相對較高,硅鞭藻綱在該水層深度最少；隨著采樣深度的增加,硅藻綱占比上升,金藻綱占比降低。但是在南部最深點D2,不同采樣深度的樣品間超微真核藻的群落組成差異較小,優勢種都是金藻綱。全湖表層樣品中超微真核藻的群落組成在不同點位也有較小的差異,位于南部湖區的D2_0和P31主要以金藻綱(Chrysophyceae)為主；偏湖區北部的D1_0、P32、P33三個點超微真核藻群落組成差異較大,P32和P33主要由金藻綱和硅藻組成,其次是綠藻綱和硅鞭藻綱。具體的超微真核藻的群落組成空間分布如表1所示。三個分組中,超微真核藻的群落組成差異不大。在D1、D2以及表層水體的5個點位中,超微真核藻主要包括不等鞭毛類、甲藻綱和綠藻綱。三個分組中分別有37、32、42個OTUs屬于自養不等鞭毛類,其中金藻綱在所有超微藻中占絕對優勢,其序列數占總序列數的比例分別為9.9%、34.3%、21.8%。

表2 撫仙湖中豐度最高的前10個OTUs及其分類信息

圖6 撫仙湖超微真核藻群落組成空間差異Fig.6 The spatial distribution of taxonomic composition of the PPEs in Lake Fuxian

3 討論

3.1 超微藻對湖泊浮游藻類生物量和初級生產力的貢獻

本研究中撫仙湖超微藻的豐度低于104個/mL,遠遠小于熱帶寡營養湖泊[16]和亞熱帶富營養湖泊[13]的105個/mL的豐度。超微藻對淡水總產量的貢獻模型基于Petersen對新西蘭8個湖泊的研究結果[22],Chla濃度處于0.57—103 μg/L。超微型浮游藻類對總碳固定的貢獻率與湖泊的營養狀況之間存在負相關。本研究中,撫仙湖的TN和TP的濃度較低,超微藻Chla對總浮游藻類Chla的平均貢獻率為67.3%,遠遠高于富營養湖泊太湖和巢湖[13]。

超微藻粒徑小,比表面積大,具有很高的營養鹽吸收速率和光捕捉效率[23-24],在低營養水平水體中,受到營養分子擴散限制的程度要低于微小型藻類[25],因此超微藻在總浮游藻類中的比例隨著水體營養鹽水平的降低而增加[24-26],超微藻對初級生產力和生物量的貢獻在貧營養湖泊中更重要[27-28]。例如,在中營養湖泊中,超微藻對總初級生產力的貢獻率為16%—58%[29],而在太平洋和大西洋營養水平較低的水域,超微藻對總初級生產力的貢獻率達到了60%—80%[30]。此外,由于超微藻具有較高的最大光合速率和光利用參數,比微小型浮游藻類更能適應冬季低溫低光照的環境[24]。

3.2 超微藍藻在撫仙湖占據優勢

本研究結果表明,撫仙湖超微藍藻的優勢度要高于超微真核藻,而在富營養化湖泊中通常超微真核藻占優勢。撫仙湖超微藍藻的主要種群是聚球藻Synechoccocus[28]。超微藍藻細胞的原核結構為它們提供了維持代謝的最低成本,這也是它們在貧營養狀態下繁殖的主要原因[31]。馬焦雷湖為期四年的超微型浮游藻類群落組成的調查研究發現,隨著營養鹽負荷的下降,該湖超微藍藻的豐度逐漸上升[32]。超微型浮游藻類的群落組成很大程度上取決于湖泊的類型和形態,湖泊垂直結構的穩定性和高水文保留時間有利于超微藍藻的生長,尤其是深度較深、面積較大的湖泊通常是超微藍藻的優選環境[32]。

3.3 撫仙湖超微真核藻的遺傳多樣性

超微真核藻和超微藍藻在湖泊中具有不同的時空分布格局,主要是因為它們對營養和光照的要求以及潛在的生長速率都不同[31]。目前為止,我們對寡營養湖泊超微真核藻的群落組成了解甚少,有研究表明金藻和隱藻是貧營養湖泊派帕文湖主要的超微真核藻類群[33]。該研究采用通用真核生物引物對逐級過濾的濾膜樣品進行18S rRNA基因克隆和測序,所得數據庫中超微真核藻序列比較低,可能偏向異養生物,會大大低估超微真核藻的多樣性。基于超微真核藻的自發熒光信號,流式細胞儀可以將其分選出來,再進行測序,這種方法使得超微真核藻在數據庫中的比例達到了60%以上,已被證明是研究超微真核藻群落組成方法學上的重要進步[34]。

富營養化湖泊中的超微真核藻主要由綠藻和硅藻組成[14,17,34]。撫仙湖研究結果表明,金藻綱、綠藻綱、甲藻綱的序列數相對其他真核藻較高,其中金藻綱的多樣性最高,具有32個OTUs,隨后是綠藻綱,有13個OTUs。因此,不同營養水平湖泊具有不同的超微真核藻群落結構。撫仙湖超微真核藻的優勢種群為綠藻、硅藻和金藻,Jaccard相似性系數與其它一些貧營養湖泊(如瀘沽湖、密歇根湖、蘇必利爾湖等)不同[14,34-35],說明撫仙湖具有獨特的超微真核藻群落結構。撫仙湖超微真核藻OTU序列豐度最高的是Dinobryonsociale。研究表明,Dinobryon存在于貧營養湖泊中,對低濃度的無機磷酸鹽具有高親和力,還有吸收有機聚合磷酸鹽的能力[36-37],此外兩個豐度排在前面的OTU屬于甲藻綱Dinophyceae,甲藻綱廣泛存在于東阿爾卑斯山區的北部和南部的高山貧營養湖泊中[38]。

4 結論

(1)水平方向上,受周圍人類活動、東部磷礦區等因素的影響,撫仙湖超微藻豐度值南部湖區高于北部,湖岸帶高于湖心區。超微真核藻和超微藍藻豐度的水平格局基本一致,但在數量上,超微藍藻細胞數占絕對優勢。

(2)垂直方向上,隨著水體深度的增加,超微藻豐度以及對總浮游藻類生物量的貢獻率呈下降的趨勢。在水下10 m處,超微藻豐度達到最大值。超微藻對總浮游藻類生物量的貢獻率則分別在北部最深點水下50 m和南部最深點30 m時最大,分別為51.3%和48.7%。光照和溫躍層是影響超微藻垂直分布差異的重要環境因子。

(3)撫仙湖超微真核藻分布在不等鞭毛類的金藻綱、甲藻綱、硅鞭藻綱和綠藻綱等類群中,金藻綱是主要的超微真核藻。在空間上,撫仙湖不同湖區和不同深度超微真核藻的群落組成也存在差異：表層水中以金藻綱、硅藻綱、甲藻綱為主；而在深層水中超微真核藻的多樣性降低,金藻綱成為優勢類群。

致謝：感謝中國科學院撫仙湖高原深水湖泊研究站提供的幫助。