金關片長期毒性研究

周 奇 楊芳炬 郝 莉

［1.華潤三九（雅安）藥業有限公司，四川 雅安 625000；2.四川大學華西基礎醫學與法醫學院，四川 成都 610000］

金關片為臨床中常用的中成藥，具有補益肝腎，祛寒止痛，活血通絡的功效，臨床用于類風濕性關節炎、強直性脊柱炎等［1-3］。金關片作為一個上市多年的藥物，臨床療效明確［4-7］，但缺乏系統的研究及評價資料報道。為擴大產品的影響力，有效地指導臨床安全用藥，根據國家食品藥品監督管理局頒發的《中藥、天然藥物長期毒性研究技術指導原則》中“慢性毒性試驗”要求，本研究進行了金關片對大鼠口服灌胃的長期毒性（180 d）試驗，以期為臨床安全用藥提供實驗依據。

1 材 料

1.1 藥物 金關片由雷公藤、續斷、山藥、細辛、附子（制）、茯苓、桑枝、桂枝、鹿角霜、秦艽、丹參、枸杞子、牛膝、雞血藤、黃精、淫羊藿、薏苡仁、黃芪等組成，每克藥粉相當于生藥3.112 g，由雅安三九藥業有限公司生產并提供，批號K-060301，長期毒性研究用時稱取藥粉以0.5%羧甲基纖維素鈉溶液配制成8%、4%、2%濃度藥液備用。

1.2 實驗動物 SD大鼠，雌雄各半，健康一級，體質量90～120 g。由四川大學實驗動物中心提供，合格證號：川實動管質第10號。動物分籠飼養觀察1周。室溫18～25℃，條狀基礎飼料。

1.3 統計學處理 應用SPSS軟件對各組數據分別計算均數和標準差，以t檢驗或t′檢驗進行各劑量組與對照組比較。

2 方法與結果

2.1 分組和給藥 大鼠按體質量分為4組，即高劑量組（0.8 g/kg體質量，相當于生藥2.49 g/kg，約為臨床用量的16倍）、中劑量組（0.4 g/kg質量，相當于生藥1.25 g/kg，約為臨床用量的8倍）、低劑量組（0.2 g/kg體質量，相當于生藥0.62 g/kg，約為臨床用量的4倍）、生理鹽水對照組（給予相同體積生理鹽水），每組30只大鼠，雌雄各半。口服灌胃給藥，每只大鼠給藥容量為1 mL/100 g，根據體質量增長調整給藥量，每周給藥6 d，每天給藥時間相同。共給藥180d，每組于給藥第90天處死6只大鼠，進行指標監測。6只停藥觀察2周（試驗時間為104 d），然后處死作同樣檢測。余下18只繼續給藥，待180d時處死余下12只進行檢測，余下6只停藥觀察2周（試驗時間為194 d），然后處死檢測。

2.2 標本采集與檢測 1）一般觀察：每日觀察體征和行為活動、糞便性狀及食量。每周稱體質量1次。2）實驗室檢查：于給藥90、104、180、194 d經股動脈采血，進行血液學（紅細胞計數及血紅蛋白、白細胞計數及其分類、網織紅細胞計數、凝血酶原時間、血小板計數）和血液生化指標［谷丙轉氨酶（ALT）、堿性磷酸梅（ALP）、谷草轉氨酶（AST）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TAG）、血糖（GLU）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、總膽紅素（Tbil）、尿素氮（BUN）、肌酐（Crea）、鈉離子濃度、鉀離子濃度、氯離子濃度、肌酸磷酸激酶］。3）病理組織學檢查：于給藥90、104、180、194 d處死動物進行系統解剖。取心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、子宮、腦、胸腺、卵巢、附睪、睪丸測定濕重并計算臟器系數。取腦、垂體、胸腺、甲狀腺、甲狀旁腺、食管、唾液腺、小腸、大腸、腎上腺、心、肝、脾、肺、腎、胰、胃、卵巢、氣管、主動脈、前列腺、乳腺、膀胱、坐骨神經、骨髓等組織常規固定、包埋、切片、HE染色，進行病理組織學檢查。

2.3 各組常規觀察和體質量增長 給藥期間，與生理鹽水對照組比，試藥組未出現體征及行為活動異常，體質量差異無統計學意義，各組食量亦無明顯差異。各劑量組與對照組體質量增長差別見圖1。

圖1 金關片對雄性大鼠體質量的影響

2.4 各組血液學及生化指標測定 試驗90 d時處死各組大鼠各6只（每組雌雄各3只）進行血液學、生化結果顯示，血液學與生化檢查見0.8、0.4 g/kg用藥組尿素氮、肌酐明顯升高（P＜0.05～0.01），其余各項指標未見異常，停藥2周動物上述血液學、生化指標檢查未見異常，中結果見圖2～圖6。

圖2 金關片給藥180 d、停藥14 d對大鼠血常規及免疫細胞的影響

圖3 金關片給藥180 d、停藥14 d對大鼠血清酶的影響

圖4 金關片給藥180 d、停藥14 d對大鼠血清TC、TAG、GLU、Tbil的影響

圖5 金關片給藥180 d、停藥14 d對大鼠血清尿素氮、肌酐和電解質的影響

圖6 金關片給藥180 d、停藥14 d對血漿蛋白的影響

實驗180 d時處死剩余動物12只同樣進行血液與生化檢查結果顯示，與對照組比，0.8 g/kg用藥組尿素氮均明顯升高（P＜0.05），其余各組各項指標未見異常；給藥180 d后停藥2周動物（各組大鼠雌雄各3只）同上法處理和檢測結果顯示，血液學、生化指標未見異常。結果詳見圖7～圖11。

圖7 金關片給藥180 d、停藥14 d對大鼠血常規及免疫細胞的影響

圖8 金關片給藥180 d、停藥14 d對大鼠血清酶的影響

圖9 金關片給藥180 d、停藥14 d對大鼠血清TC、TAG、GLU、Tbil的影響

圖10 金關片給藥180 d、停藥14 d對大鼠血清BUN、Crea和電解質的影響

圖11 金關片給藥180 d、停藥14 d對血漿蛋白的影響

2.5 各組系統解剖及病理組織學檢查 給藥90 d、停藥14 d各用藥組進行系統解剖觀察結果顯示，肉眼未見臟器明顯異常；腦、心、肝、脾、肺、腎、腎上腺、甲狀腺、胰、胃臟器濕重和臟器系數與對照組比，無顯著差異；臟器稱重結果顯示，與對照組比，0.8、0.4 g/kg用藥組雄鼠睪丸質量均出現明顯減輕（P＜0.05），0.8 g/kg用藥組雌鼠子宮質量亦出現明顯減輕（P＜0.05）；病理切片檢查見0.8 g/kg用藥組雄鼠睪丸出現病理改變，表現為生精細胞減少，精管細胞減少甚至消失，停藥14 d亦無明顯改善，見圖12。其他各組各臟器未見明顯病理改變。

給藥180 d、停藥14 d各用藥組進行的系統解剖觀察結果顯示，180 d用藥（0.8 g/kg）組肉眼見大鼠脾臟淤血，但其質量無增加或減輕；0.8、0.4、0.2 g/kg用藥組雄鼠睪丸質量明顯減輕（P＜0.01）；同時，0.8 g/kg用藥組雌鼠子宮質量明顯減輕（P＜0.01）；各給藥動物經病理切片觀察仍見0.8 g/kg組雄鼠睪丸出現類似90 d用藥組改變；子宮雖見質量減輕，但未見結構異常改變，脾臟亦未見結構異常；其余各臟器或組織亦無異常病理改變。各試藥組子宮、睪丸、附睪質量結果詳見圖13、圖14。

圖13 金關片給藥90 d后對生殖系統臟器質量的影響

圖14 金關片給藥180 d后對生殖系統臟器質量的影響

給藥90、104、180、194 d分別取部分大鼠骨髓涂片檢查，結果顯示：骨髓有核細胞增生活躍，粒細胞、紅細胞各系各階段比例基本正常，形態無異常改變。表明該藥物對骨髓無不良影響。

3 討 論

金關片每日0.2 g/kg（相當于0.62 g生藥/kg，約為臨床用藥量的4倍）連續給藥180 d，各項指標及病理學觀察，均未見毒性反應和對臟器器官的損害。故認為金關片臨床治療量（0.06 g/kg，相當于0.1556 g生藥/kg）是安全的。綜上可以看出，金關片對大鼠未見明顯的長期毒性，提示金關片在臨床推薦劑量下服用是安全的。

結合金關片的藥效研究報道［1，3，8］，該藥能治療寒濕阻絡證、瘀血阻絡證、肝腎兩虛證之類風濕頑痹。由于雷公藤是金關片中的君藥，是治療關節炎和風濕病的特效藥材，大量文獻報道其對精子有殺傷力［9-11］。從長期毒性研究中可以看出金關片對雄性大鼠生殖系統作用存在一定的影響，但關金片中雷公藤的含量低，且發現停藥90 d后，精子數量和功能完全恢復，不影響生育［12］。金關片與同類產品雷公藤片臨床療效比較［3］，療效無明顯差異，用于治療類風濕性關節炎均有較好療效（總有效率分別為97.2%、96.4%），但雷公藤片不良反應高、復發率高，因而金關片是值得推廣應用的治療類風濕性關節炎疾病的較好藥物。

近期研究發現，金關片能顯著降低高尿酸血癥小鼠尿酸水平；并顯著降低高尿酸血癥所致的高BUN、高Crea水平；對模型形成過程小鼠血清中尿酸水平有良好抑制效果［9］。類風濕關節炎［13］以及高尿酸血癥［14-15］均是臨床中常見的疾病，其癥狀和并發癥嚴重影響患者生活質量。隨著金關片新功效的不斷發現以及臨床應用的推廣，金關片主要用于慢性疾病的治療，需要較長時間服用藥物，因此系統的評價和報道金關片的長期毒性具有重要的臨床指導意義。通過本研究表明金關片屬于副作用較小，毒性不明顯的中成藥，為藥物綜合評價提供可靠的實驗數據。