LINC01359在顱內動脈瘤患者血清中的表達及對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響

印辰宇,季愛平,季海明,劉藝春,楊海峰

(1江蘇省泰興市人民醫院神經外科,泰興 225400;2華中科技大學附屬同濟醫院神經外科;*通訊作者,E-mail:hfwhstongji2016@126.com)

顱內動脈瘤主要發生在顱內動脈分叉部位,是動脈血管壁由于血管平滑肌細胞凋亡引起的瘤樣凸起[1,2]。動脈瘤破裂是蛛網膜下腔出血的主要病因,患者死亡率較高且預后較差[3,4]。探究動脈瘤的發生和發展機制,對預防和治療動脈瘤至關重要。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類長度超過200個核苷酸的無編碼功能的單鏈RNA,近年來動脈瘤的分子研究發現lncRNA與動脈瘤的發病密切相關[5]。lncRNA通過調節基因表達,影響血管平滑肌細胞的功能,介導動脈瘤的發生和發展[6]。同時,血清中特異性表達的lncRNA可作為動脈瘤形成的分子標志物[7]。LINC01359為lncRNA之一,存在于人血清中,可能成為肝癌非侵襲的標志物[8]。然而,LINC01359與動脈瘤的關系尚不清楚。本研究旨在分析LINC01359在動脈瘤患者血清中的表達水平,探究LINC01359對血管平滑肌細胞增殖和凋亡的影響及可能的分子調節機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株和試劑

人血管平滑肌細胞(HVSMC)購自中國科學院生物化學與細胞生物學研究所。含有si-LINC01359序列的人重組慢病毒載體MCS-CMV-si、空載病毒MCS-CMV、LINC01359野生型及突變型重組雙熒光素酶報告載體(LINC01359-WT、LINC01359-Mut)、miR-504-5p模擬物及對照物,購自上海吉凱生物技術有限公司。DMEM培養基、胎牛血清購自美國GIBOCO公司。雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒和MTS試劑盒購自美國Promega公司。實時定量聚合酶鏈反應(qRT-PCR)試劑盒購于日本Takara公司。Annexin Ⅴ/7-AAD雙染法檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司。一抗(Bak、β-actin、Caspase-9、Bcl-xL和Bcl-w)購于美國Abcam公司。

1.2 臨床資料

納入2019年7月至2021年4月間江蘇省泰興市人民醫院神經外科診治的顱內動脈瘤患者40例,其中男27例,女13例,年齡43-73歲,平均(61.35±15.52)歲;同期收集40例本醫院體檢中心無顱內動脈瘤者為健康組,其中男21例,女19例,年齡48-79歲,平均(66.18±12.56)。顱內動脈瘤患者均經數字減影血管造影確診。本研究經本醫院倫理委員會批準,患者和健康體檢者均簽署知情同意書。

1.3 細胞培養和慢病毒感染

常規復蘇HVSMC細胞,用含10%胎牛血清的DMEM培養基常規培養(37 ℃、5% CO2)。將對數生長期的HVSMC細胞接種至6孔細胞培養板,設置感染復數(MOI=80),分別感染重組慢病毒載體MCS-CMV-si(si-LINC01359組)或空載病毒MCS-CMV(空白對照組)。感染后96 h,熒光顯微鏡評估轉染效率。

1.4 qRT-PCR檢測LINC01359和miR-504-5p的表達水平

TRIzol法提取血清或者細胞總RNA,逆轉錄合成cDNA。建立qRT-PCR反應體系,循環擴增30次。引物序列如下,miR-504-5p正向:5′-TCTACACAGGTTGGGATCGG-3′,反向:5′-CGGGACAAGTGCAATACCATA-3′;U6正向:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向:5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。GAPDH正向:5′-GTCATCCCTGAGCTGAACGG-3′,反向:5′-CCACCTGGTGCTCAGTGTAG-3′;LINC01359正向:5′-TGGCTATTTCAGGTCCCTTG-3′,反向:5′-TGAGCTGAGATCATGCAACC-3′。LINC01359表達水平以GAPDH為內參,miR-504-5p表達水平以U6為內參。所得循環值經2-ΔΔCt法計算LINC01359和miR-504-5p表達水平。

1.5 MTS法檢測細胞活力

取空白對照組和si-LINC01359組對數生長期HVSMC細胞,以約5×103個細胞/孔接種于96孔板,每組5個平行復孔。加入30 μl/孔的MTS試劑,培養箱內靜置3 h,調節酶標儀波長為490 nm,讀取每孔光密度(OD)值,取平均值。分別在24,48,72,96 h用MTS法檢測細胞活力。

1.6 Annexin Ⅴ/7-AAD雙染法檢測細胞凋亡率

胰蛋白酶消化收集空白對照組和si-LINC01359組對數生長期的HVSMC細胞,PBS溶液洗3次,加入150 μl結合緩沖液重懸,加入10 μl Annexin Ⅴ-PE溶液混勻,加入10 μl 7-AAD溶液混勻,避光孵育20 min。加入200 μl結合緩沖液,采用流式細胞儀分析空白對照組和si-LINC01359組細胞凋亡變化。

1.7 生物信息學方法和雙熒光素酶報告基因實驗預測和驗證LINC01359的靶基因

通過生物信息學數據庫Starbase預測LINC01359的潛在作用靶點。分別轉染LINC01359-WT、LINC01359-Mut與miR-504-5p模擬物或miR-504-5p對照物至HVSMC細朎,共轉染48 h。通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測每組HVSMC細胞的相對熒光素酶活性。

1.8 Western blot法檢測凋亡相關蛋白含量

通過細胞裂解液提取空白對照組和si-LINC01359組對數生長期細胞總蛋白,每組取30 μg體系在十二烷基聚丙烯酰胺凝膠中電泳,硝酸纖維素膜轉膜,在6%脫脂牛奶中封閉3 h。以1 ∶2 000的比例稀釋一抗,4 ℃孵育16 h,在37 ℃下二抗(1 ∶7 000稀釋比例)孵育3 h。采用增強型化學發光試劑顯影,在凝膠成像儀中成像并拍照。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 動脈瘤患者血清中LINC01359表達水平

qRT-PCR結果顯示,動脈瘤患者和健康組血清中LINC01359相對表達分別為7.76±1.17和0.95±0.27,動脈瘤患者血清LINC01359表達水平較健康對照顯著升高(P<0.01,見圖1)。

與健康組比較,**P<0.01圖1 動脈瘤組患者和健康組血清中LINC01359的相對表達Figure 1 The relative expression of LINC01359 in the serum of patients with aneurysm and healthy controls

2.2 重組慢病毒載體在HVSMC細胞中的綠色熒光蛋白表達及感染效率

將重組慢病毒載體感染HVSMC細胞,熒光顯微鏡下觀察每組細胞的熒光表達,綠色熒光代表感染成功(見圖2)。空白對照組和si-LINC01359組培養基中LINC01359相對表達分別為5.53±0.37和1.09±0.15,差異有統計學意義(P<0.01),說明構建的重組慢病毒載體MCS-CMV-si能夠抑制LINC01359表達。

圖2 空白對照組和si-LINC01359組熒光檢測Figure 2 Fluorescence staining in blank control group and si-LINC01359 group

2.3 低表達LINC01359對HVSMC細胞增殖的影響

MTS法結果顯示,各組HVSMC細胞在處理后48,72,96 h,si-LINC01359組的OD值明顯低于空白對照組(P<0.05,見圖3),說明低表達LINC01359能夠有效抑制HVSMC細胞的增殖。

2.4 低表達LINC01359對細胞凋亡率的影響

流式細胞儀檢測HVSMC細胞凋亡率顯示,si-LINC01359組和空白對照組HVSMC細胞凋亡率分別為(21.86±4.97)%和(54.18±4.96)%,si-LINC01359組較空白對照組細胞凋亡率明顯減低(P<0.01,見圖4)。

與空白對照組相比,*P<0.05,**P<0.01圖3 MTS法檢測各組HVSMC細胞增殖率的改變Figure 3 Proliferation rate of HVSMCs in each group detected by MTS method

圖4 Annexin Ⅴ/7-AAD雙染法檢測各組細胞凋亡率Figure 4 Apoptosis rate in each group detected by Annexin Ⅴ/7-AAD double staining method

2.5 LINC01359靶基因分析和雙熒光素酶報告基因實驗

通過生物信息學數據庫Starbase分析顯示LINC01359的潛在靶基因可能是miR-504-5p(見圖5)。雙熒光素酶報告基因檢測結果顯示,共轉染LINC01359-WT和miR-504-5p模擬物的細胞相對熒光素酶活性較共轉染LINC01359-WT和miR-504-5p對照物的相對熒光素酶活性降低(0.29±0.03vs1.07±0.17,P<0.01),而共轉染LINC01359-Mut和miR-504-5p模擬物的細胞相對熒光素酶活性較共轉染LINC01359-Mut和miR-504-5p對照物的差異無統計學意義(1.10±0.16vs1.03±0.10,P>0.05)。

圖5 LINC01359與miR-504-5p的結合位點Figure 5 The binding site of LINC01359 and miR-504-5p

2.6 低表達LINC01359對HVSMC細胞中miR-504-5p表達的影響

qRT-PCR結果顯示,si-LINC01359組HVSMC細胞miR-504-5p相對水平高達6.26±0.81,而空白對照組HVSMC細胞miR-504-5p相對表達僅1.03±0.27,即低表達LINC01359可上調HVSMC細胞miR-504-5p相對表達(P<0.01)。

2.7 低表達LINC01359對凋亡相關蛋白含量的影響

Western blot結果顯示,與空白對照組相比,低表達LINC01359的細胞中抗凋亡因子Bcl-xL和Bcl-w蛋白表達增多,促凋亡因子Bak和Caspase-9蛋白表達降低(見圖6)。

圖6 Western blot法檢測凋亡相關蛋白的表達Figure 6 Expression of apoptosis-related proteins detected by Western blot

3 討論

血管平滑肌細胞是構成血管壁的主要細胞,在維持血管的張力和調節血管的重塑方面發揮重要作用[9]。血管平滑肌細胞的凋亡,引起血管內皮功能破壞,是動脈瘤形成的關鍵因素[10]。lncRNA表達異常是介導血管平滑肌細胞功能障礙,誘發動脈瘤發病的關鍵因子[11]。Xu等[12]研究發現,顱內動脈瘤患者的血液中lncRNA HIF1A-AS1表達水平上調,其表達水平與顱內動脈瘤呈正相關,lncRNA HIF1A-AS1過表達抑制血管平滑肌細胞的增殖。Man等[13]研究發現,血清lncRNA GASL1表達下調可有效區分顱內動脈瘤患者與健康志愿者,lncRNA GASL1過表達促進人血管平滑肌細胞增殖并下調轉化生長因子-β1的表達。最近研究表明,LINC01359在肝癌患者血清中表達顯著上調,是肝癌診斷和進展的生物標志物[8]。但LINC01359是否能夠影響動脈瘤的形成并不明確。

本研究結果顯示,動脈瘤患者血清中LINC01359表達明顯高于健康體檢者,LINC01359可能成為動脈瘤的血清標志物,其在動脈瘤的形成過程中可能發揮負面效應。血管平滑肌細胞的增殖與凋亡的平衡對維持血管內皮功能的穩定具有重要意義,調控血管平滑肌細胞的增殖和凋亡是研究動脈瘤預防、診療和預后的有效方法[14,15]。本研究通過慢病毒感染敲低LINC01359表達,LINC01359低表達能夠有效抑制HVSMC細胞的凋亡并促進其增殖。lncRNA通過與靶基因微小RNA(miRNA)結合配對,負向調控靶基因miRNA的表達,參與血管平滑肌細胞的凋亡、增殖等活動[16,17]。本研究通過Starbase數據庫預測,LINC01359的靶基因miRNA可能是miR-504-5p。雙熒光素素酶報告基因證實LINC01359可結合配對miR-504-5p。已有的研究[18]發現,miR-504-5p在動脈瘤患者的血管平滑肌細胞中的表達降低,miR-504-5p過表達顯著上調抗凋亡因子的表達、下調促凋亡因子的表達,發揮明顯的抗凋亡作用,同時miR-504-5p可促進血管平滑肌細胞的增殖。本研究顯示,抑制LINC01359表達后,miR-504-5p的表達顯著增加,表明LINC01359通過調節miR-504-5p表達發揮作用。本研究Wes-tern blot顯示,低表達LINC01359的細胞中抗凋亡因子Bcl-xL和Bcl-w蛋白表達增多,促凋亡因子Bak和Caspase-9蛋白表達降低,進一步證實了HVSMC細胞中LINC01359的抗凋亡作用。

綜上所述,本研究證實動脈瘤患者血清中LINC01359表達顯著升高,LINC01359高表達與動脈瘤的形成密切相關。敲低LINC01359通過有效提高miR-504-5p的表達水平,促進HVSMC細胞的增殖并抑制HVSMC細胞的凋亡發生。LINC01359在血管平滑肌細胞中的功能研究為動脈瘤的發生機制研究提供了新的思路。