利用斑馬魚模型與代謝組學技術研究瓦他拉尼抑制血管生成的作用及其機制

吳曉敏,董 榕,陳善軍,劉擁軍,楊官娥,韓利文*

(1山東第一醫科大學,山東省醫學科學院藥學與制藥科學學院藥物分析教研室,濟南 256200;2晉中市第二人民醫院藥劑科;3山西醫科大學藥學院中藥教研室;*通訊作者,E-mail:hanliwen08@126.com;#共同通訊作者,E-mail:yangguane08@aliyun.com)

血管生成與腫瘤的發生發展密切相關。1971年Folkman首次提出“餓死”腫瘤療法,該療法主要通過阻斷血管生成,抑制腫瘤營養、能量的供應等方式,最終實現“餓死”腫瘤的目的?？寡苌墒丘囸I療法最重要的作用方式,以腫瘤血管為靶點,抑制血管生成或破壞血管,阻斷血管的營養通路[1]。瓦他拉尼(vatalanib)是由諾華和先靈公司共同開發的酪氨酸激酶小分子抑制劑,為血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)和血小板衍生生長因子受體(platelet-derived growth factor receptor,PDGFR)雙靶點抑制劑,通過抑制血管生成而發揮抗癌作用,口服用于結腸癌、直腸癌、乳腺癌、腦腫瘤和腎癌的臨床治療。研究顯示,瓦他拉尼直接作用于VEGF受體的ATP結合位點,此外,還可抑制上皮細胞的遷移和增殖[2,3]。近10年來,抗腫瘤靶向血管的藥物不斷涌現,但是在臨床的綜合療效并未達到人們預期,提示對該類制劑作用機制的了解并不全面,有必要進行深入研究。

在腫瘤發生過程中,新生的血管與腫瘤組織伴行,無法獨立研究。斑馬魚是目前理想的用于研究血管形成的整體實驗動物模型,不受腫瘤組織干擾。本實驗采用綠色熒光蛋白GFP標記血管內皮因子Ⅱ型受體的轉基因斑馬魚品系,能夠在熒光鏡下清楚地觀察到斑馬魚的血管形成過程[4-6]。斑馬魚的血管由內皮細胞芽生而產生新的微血管,直至形成血管網,可以從整體水平上觀察血管自胚胎到成熟個體的完整發育過程,還可以從代謝物水平探討影響血管生成的機制[7,8]。

代謝組學作為后基因時代的一種全新的組學技術,利用高分離效率、高靈敏度及極低檢測限的儀器,以生物體內低分子量物質的動態規律變化來表征生物體的生理病理變化趨勢,最終通過還原相關聯事件,揭示生物體的病理生理變化趨勢和機制[9-12]。本研究采用代謝組學技術探討瓦他拉尼抑制斑馬魚血管生成引起的內源性小分子代謝物的變化,為深入了解瓦他拉尼抑制腫瘤的機制提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 轉基因斑馬魚 Tg(VEGFR2:GFP)系轉基因斑馬魚,山東省科學院生物研究所提供。

1.1.2 主要儀器與試劑 Agilent 7890A-5975C型氣質聯用儀、Scientz UW3100型組織細胞破碎儀、Eppendorf SC18型G低溫臺式離心機、Stuart SBH200D/3型氮吹型樣品濃縮儀、奧林巴斯SZX16熒光顯微鏡。鏈霉蛋白酶Pronase E,活性≥7 000 U/g,由Solarbio公司提供。瓦他拉尼(1-(4-氯苯胺基)-4-(4-甲基吡啶基)-2,3-二氮雜萘琥珀酸鹽),購自Sigma公司,含量為98.3%。

1.1.3 數據分析軟件 Agilent GC-MSD ChemStation工作站、SIMCA-P 18.0、SPSS 25.0統計軟件、XCMS、R分析軟件。

1.2 實驗方法

1.2.2 斑馬魚代謝物的提取 將斑馬魚胚胎轉移至1.5 ml EP管中,純凈水洗滌3次,吸盡水分。加入磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)130 μl提取,研珠破碎,超聲10 min,4 000 r/min離心10 min,取上清液100 μl,加入400 μl乙腈,渦旋混合30 s,靜置15 min;15 000 r/min,4 ℃離心5 min,取上清液400 μl備用。

1.2.3 斑馬魚代謝物的衍生化 將提取液400 μl用氮吹儀吹干,加入甲氧胺吡啶溶液(10 mg/ml)50 μl,于70 ℃恒溫箱中反應1 h,加入BSTFA(含1%TMCS)50 μl,渦旋混合30 s,70 ℃水浴30 min,加入正庚烷150 μl,吸取上清液200 μl,用于GC-MS分析。

1.2.4 GC-MS分析 使用Agilent 7890A-5975C型氣質聯用儀對斑馬魚代謝物樣本進行分析,程序升溫條件:初始柱溫70 ℃,保留5 min,以10 ℃/min升溫至100 ℃,保留12 min,再以5 ℃/min升溫至180 ℃,保留6 min,最后以5 ℃/min升溫至300 ℃,保留5 min。

1.2.5 數據處理 數據預處理:將所要分析的GC-MS源數據導入GC/MSD ChemStation工作站,轉換為CDF格式,之后導入XCMS軟件中進行峰對齊。軟件設置參數:full width at half-maximum: fwhm=4;S/N cutoff value: snthresh=10,max=20,group(bw=10),將軟件所生成txt文件導入Excel軟件中進行數據處理,得到一個包含豐度、保留時間、質核比的三維矩陣化合物數據表。

多元統計分析:將所得數據矩陣導入SIMCA-P 18.0軟件建模,進行主成分(PCA)分析及偏最小二乘法-模式判別(PLS-DA)分析,觀察斑馬魚的節間血管被抑制以及恢復后代謝輪廓的變化。然后通過S-Plot圖遠端離散數據點、變量權重(variable importance, VIP)>1、P<0.05、變量的CIJFJK值不跨越0等4個條件綜合篩選組間差異相關的潛在生物標志物。

1.2.6 差異代謝物的鑒定 實驗中為了更好地確認未知峰的化合物名稱,采用標準品進行指認,以保證化合物確認的準確性。將標準品配置好后按照斑馬魚樣本處理方法處理,使用氣質聯用儀對標準品混合物進行分析,將標準品的圖譜同美國國家標準技術研究院(NIST)庫進行數據比對,找出標準品的質譜碎片以及色譜圖的保留時間。

2 結果

2.1 瓦他拉尼對斑馬魚節間血管生成的影響

結果顯示隨著發育時間的延長,斑馬魚節間血管的長度逐漸變長,因此,比較藥物對斑馬魚血管的抑制作用只能通過和同一發育時間的對照組比較。當斑馬魚發育至24 hpf時,軀干部的體節間血管開始發育。加入瓦塔拉尼處理12 h后,斑馬魚的節間血管受到明顯抑制。去除瓦塔拉尼藥液后,繼續在正常的培養水中孵育至72 hpf,斑馬魚的節間血管逐漸得到恢復(見圖1)。

圖1 瓦他拉尼處理后斑馬魚節間血管的隨時間的生長情況Figure 1 Development of ISVs in zebrafish after vatalanib treatment

在所有實驗組進行至72 hpf時,瓦他拉尼處理過的斑馬魚節間血管總長度明顯縮短(見圖2),與對照組的節間血管的長度相比差異有統計學意義(P<0.01)。先用瓦塔拉尼處理斑馬魚12 h然后移除藥物培養至72 hpf,斑馬魚的節間血管長度與瓦塔拉尼組相比也體現了顯著性差異(P<0.01),說明瓦塔拉尼抑制的血管得到了明顯的恢復。

2.2 代謝組學分析

首先使用代謝組學PCA法對三組數據進行分析,發現瓦他拉尼組與對照組、恢復組在PCA分析中呈現離散的趨勢,但恢復組與空白對照組不能完全區分。進一步通過PLS-DA法發現斑馬魚對照組、瓦他拉尼組與恢復組可以明顯區分(見圖3A)。通過7次模型交叉驗證,發現模型Q2,R2的值符合要求,模型沒有過擬合(見圖3B)。從圖3中看出瓦他拉尼組、對照組、恢復組有明顯的離散趨勢,并且R2X=0.832,R2Y=0.984,Q2Y=0.864,分別表示模型概括X矩陣的解釋率為83.2%,模型的穩定性為98.4%,模型的預測性為86.4%。結果顯示斑馬魚節間血管恢復組比較靠近對照組,且由對照組到瓦他拉尼組再到恢復組的夾角呈現銳角,顯示了瓦他拉尼對血管生成的抑制、再轉歸的代謝輪廓變化特征。

與對照組比,**P<0.01;與瓦他拉尼組比較,##P<0.01圖2 瓦塔拉尼處理后斑馬魚至72 hpf節間血管的抑制及恢復情況Figure 2 Inhibition and recovery of ISVs in zebrafish at 72 hpf after vatalanib treatment

圖3 PLS-DA模型分析結果Figure 3 Analytical results of PLS-DA model

2.3 差異代謝物分析

VIP值是PLS-DA監督性分析方法中評價變量貢獻大小的常用方法,一般選擇VIP>1的變量。本實驗依據VIP值篩選到232個成分離子符合條件。圖4A展示了前130個成分離子的VIP值,綠色變量表示其CIJFJK值跨越了0值,不符合實驗予以進行剔除。

PLS-DA模型的Loading載荷圖結果顯示,大部分的樣品成分離子集中在坐標軸原點附近,少數成分離子散落在離原點較遠的位置,因此根據距離原點的距離,選取較遠的167個成分離子作為潛在的生物標志物(見圖4B)。

圖4 斑馬魚樣本差異代謝物的篩選結果Figure 4 Screening results of target metabolites in zebrafish samples

綜合同時符合VIP值及遠端離散點兩個條件的成分離子,進行P值計算,根據P<0.05的條件,進一步篩選符合條件的成分離子。然后通過成分離子碎片與對照品比對、NIST數據庫檢索等方式,鑒定出對應的代謝物結構。本研究發現丙酮酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘油、磷酸、絲氨酸、脯氨酸、葡萄糖、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、酪氨酸、棕櫚酸、硬脂酸、膽固醇16種代謝物同時與血管生成的抑制和恢復有關(見表1),推測這些代謝物可能為與血管生成相關的內源性生物標志物,這些代謝物涉及到糖酵解、氨基酸酸代謝、糖代謝、脂質代謝等多個生物學過程。

表1 斑馬魚血管生成可能相關的生物標志物Table 1 Possible biomarkers related to angiogenesis in zebrafish

3 討論

瓦他拉尼通過抑制血管內皮生長因子受體(VEGFR),使腫瘤組織中的血管生成受到抑制,細胞缺少氧氣及營養成分,從而抑制腫瘤的生長[13]。而VEGFR-2是血管內皮生長因子信號調節血管生成的主要受體。目前,關于瓦他拉尼抑制血管生成機制的報道相對較少。Neves等[14]研究發現NOXS和抗氧化酶是瓦他拉尼導致血管功能障礙的新靶點。韓利文等[15]研究發現瓦他拉尼抑制血管生成可能與纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸生物合成途徑、苯丙氨酸-酪氨酸-色氨酸合成途徑、苯丙氨酸代謝、甘氨酸-天冬氨酸-谷氨酰胺代謝、磷酸肌醇代謝途徑有關。

本研究結果顯示,瓦他拉尼抑制斑馬魚血管生成過程可能與糖酵解、脂類代謝、氨基酸代謝有關。葡萄糖、丙酮酸作為糖酵解的代謝產物,提示瓦他拉尼抑制斑馬魚血管生成可能與糖酵解代謝途徑有關。血管生成受到阻礙后,營養和氧氣無法供應周圍組織的生長需要,周圍組織處于低氧、缺血環境中。為了適應低氧微環境,血管區糖酵解增加。已有的研究證實,腫瘤細胞中也存在糖酵解作用,即所稱的Warburg效應(Warburg effect)[16]。即腫瘤細胞獲得ATP的方式發生明顯改變,即使氧氣供應充足,有氧氧化也會減弱,而糖酵解則增強。從腫瘤與血管生成的對應關系,該說法也暗示血管生成被抑制后會造成糖酵解作用增強[17]。

另外,棕櫚酸、硬脂酸作為花生四烯酸合成的原料,硬脂酸、棕櫚酸水平降低,提示斑馬魚體內血管生成被抑制可能與花生四烯酸有關?；ㄉ南┧崾蔷S持細胞膜結構和功能所必需,其在環氧酶和前列環素合成酶效用下,合成前列環素(PGI2),參與機體炎癥反應[18]。趙敏等[19]研究大鼠血管損傷實驗炎性機制研究表明,血管損傷與炎性狀態具有相關性,血管生成障礙后,檢測到體內炎癥因子TNF-α和IL-6表達水平升高,暗示介導炎癥的花生四烯酸含量升高,合成原料棕櫚酸、硬脂酸含量降低。血管生成被抑制時,膽固醇含量下調。血管生成恢復后,膽固醇含量升高,提示血管生成作用與膽固醇相關。盧志順等[20]利用人內皮靜脈細胞研究膽固醇對血管損傷的作用,結果顯示膽固醇可以增加血管內皮細胞膜的通透性,對細胞造成了損傷。因此,瓦他拉尼抑制斑馬魚血管生成可能與體內花生四烯酸、膽固醇的合成通路相關,與體內的脂代謝途徑有關。

綜上,采用斑馬魚模型研究血管生成作用具有明顯優勢。常規的動物模型腫瘤和血管生成是同時存在的,而斑馬魚的血管生成模型,能夠把血管生成獨立出來研究,無須考慮腫瘤等其他因素的干擾。本實驗中采用血管自行恢復的方法,避免了藥物恢復血管帶來的體內內源性代謝物的變化,在一定程度上從內源性代謝網絡角度揭示了瓦他拉尼抑制血管的分子機制,也為同類的靶向抗腫瘤藥研發提供一定的借鑒意義。

致謝:特別感謝山東省科學院生物研究所為本研究提供斑馬魚資源及實驗條件。