5-羥色胺通過5-羥色胺2A受體對肺動脈成纖維細胞的激活作用

韓新源,王順達,雍志軍,張雪婷,王暄齊,楊俊生

(陜西省人民醫院康復醫學科,西安 710068;*通訊作者,E-mail:hanxinyuan0408@163.com)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension, PAH)是一種由多種原因造成的臨床及病理生理綜合征,以肺血管阻力增加和肺動脈壓力升高為特征,嚴重者可發展成右心衰竭甚至死亡[1]。肺血管重構造成的肺血管結構或功能改變是肺動脈高壓最重要的發病機制[2]。研究發現,肺血管重構的一個根本問題是肺血管外膜成纖維細胞(pulmonary artery adventitial fibroblasts,PAFs)的持續激活,表現為PAFs增殖、分化、分泌和代謝異常[3]。而目前PAH的治療方法并沒有直接針對此問題,因此,如何抑制PAFs的異常活化是控制PAH肺血管重構的關鍵問題。

5-羥色胺(serotonin,5-hydroxytryptamine,5-HT)是一種血管活性物質,既往的研究發現5-HT是參與PAH形成和發展的重要分子[4]。5-HT通過與細胞膜上的受體和轉運體結合而發揮作用,目前發現的5-HT受體可以分為7個家族,其中5-HT2A受體已被證明與PAH的發生相關[5-7]。本課題組既往的研究結果顯示,5-HT2A受體阻滯劑鹽酸沙格雷酯能夠降低野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠肺動脈壓,減輕肺動脈纖維化、改善肺動脈重構[8]。本研究在細胞水平觀察5-HT2A受體對5-HT誘導的肺動脈外膜成纖維細胞激活及血管外間質異常沉積的影響,為肺動脈高壓的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

5-HT購于英國Tocris公司;噻唑藍(MTT)、二甲基亞砜、5-HT2A受體拮抗劑Ketanserin(S006)、5-HT2A受體激動劑1-(2,5-二甲氧基-4-碘苯基)-2-氨基丙烷鹽酸鹽(1-(2,5-dimethoxy-4-iodophenyl)-2-aminopropane,DOI)購自美國Sigma公司;Transwell遷移小室購自美國Corning公司;α-SMA兔抗大鼠多克隆抗體購自美國Abcam公司;Fn小鼠抗大鼠單克隆抗體、Col-Ⅰ兔抗大鼠多克隆抗體、CTGF羊抗大鼠多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.2 大鼠原代肺動脈成纖維細胞的分離與培養

參照Welsh等[9]的血管成纖維細胞分離方法,分離原代肺動脈成纖維細胞。當細胞生長到融合鋪滿培養瓶底80%時,加入0.25%的胰蛋白酶消化傳代接種到培養瓶中,傳代培養時使用DMEM培養基,置于37 ℃、5%CO2的培養箱中培養,保持細胞形態穩定。隨后的實驗使用第3代對數期生長的細胞。

1.3 細胞分組及處理方法

無血清培養基培養24 h后,將PAFs隨機分為4組:對照組、5-HT組、5-HT+Ketanserin組、DOI組。對照組不做處理,5-HT組加入濃度為10-6mol/L的5-HT,5-HT+Ketanserin組加入濃度為10-6mol/L的5-HT和10-6mol/L Ketanserin,其中Ketanserin在5-HT加入前30 min加入細胞培養液;DOI組加入濃度為10-6mol/L的DOI,37 ℃、5%CO2的培養箱培養24 h。

1.4 MTT法檢測PAFs增殖

在96孔板中培養PAFs,待細胞單層鋪滿孔底,細胞于無血清的DMEM培養液中孵育24 h,每組設立5個復孔;按照1.3分組處理PAFs,細胞干預完成后,去除培養液,使用PBS將每孔細胞洗2次;每孔加入200 μl培養液和0.5%MTT 20 μl,繼續培養4 h;終止培養,吸棄培養液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,置搖床上避光低速振蕩10 min,使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀OD490 nm處測量各孔的吸光值,每組5孔吸光值平均后作為該組單次實驗結果。實驗重復3次。

1.5 Transwell法檢測PAFs遷移

按照1.3分組處理PAFs,用無血清的培養基重懸并計數細胞,調整細胞密度至1×105/ml,取細胞懸液100 μl加入Transwell小室,5% CO2,37 ℃培養24 h。取出Transwell小室,棄去孔中培養液,用棉簽輕輕擦掉上層未遷移細胞。用無菌的PBS洗3次,無水乙醇固定30 min,將小室適當風干。室溫下,0.1%結晶紫染色30 min,用PBS洗滌后,200倍顯微鏡下隨機取不同視野觀察細胞,統計每個視野中的遷移細胞數并計算平均值并拍照。

1.6 Western blot檢測蛋白水平

按照1.3分組處理PAFs,待細胞干預完成后,提取蛋白并進行蛋白濃度測定及蛋白變性。10%聚丙烯酰氨凝膠電泳,轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶室溫封閉1 h。分別加入α-SMA(1 ∶500)、CTGF(1 ∶200)、Col-Ⅰ(1 ∶200)、Fn(1 ∶200)抗體和GAPDH抗體(1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBST洗膜,二抗室溫孵育1 h,TBST洗膜,電化學發光試劑(Bio-Rad)暗室顯影。Quantity one軟件分析目的蛋白與內參GAPDH蛋白灰度值,計算相對灰度值。

1.7 數據統計分析

2 結果

2.1 各組PAFs細胞增殖情況

MTT結果顯示,與對照組相比,5-HT組PAFs細胞OD值顯著升高(0.70±0.03vs0.96±0.02,P<0.01);與5-HT組相比,5-HT+Ketanserin組PAFs細胞OD值顯著降低(0.96±0.02vs0.75±0.04,P<0.01);與對照組相比,DOI組PAFs細胞OD值顯著升高(0.70±0.03vs0.82±0.03,P<0.05,見圖1)。

與對照組比較,*P<0.05,**P<0.01;與5-HT組比較,##P<0.01圖1 5-HT及5-HT2A受體拮抗劑、5-HT2A受體激動劑對PAFs細胞增殖的影響Figure 1 Effect of 5-HT and 5-HT2A receptor antagonist,5-HT2A receptor agonist on proliferation of PAFs

2.2 各組PAFs細胞遷移情況

與對照組相比,5-HT組PAFs細胞遷移細胞數顯著增加(P<0.01);與5-HT組相比,5-HT+Ketanserin組PAFs細胞遷移細胞數顯著減少(P<0.01);與對照組相比,DOI組PAFs細胞遷移細胞數顯著增加(P<0.01,見圖2)。

圖2 5-HT及5-HT2A受體拮抗劑、5-HT2A受體激動劑對PAFs細胞遷移的影響 (×200)Figure 2 Effect of 5-HT and 5-HT2A receptor antagonist,5-HT2A receptor agonist on migration of PAFs (×200)

2.3 各組PAFs細胞中α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表達情況

與對照組相比,5-HT組PAFs細胞α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表達水平均顯著升高(P<0.01);與5-HT組相比,5-HT+Ketanserin組PAFs細胞α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表達水平顯著降低(P<0.01);與對照組相比,DOI組PAFs細胞α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表達水平顯著升高(P<0.01,見圖3)。

3 討論

肺血管重構是PAH的特征性病理改變和病情難以逆轉的重要因素。在肺血管重構的過程中,肺動脈壁的三層血管結構即內膜、中膜和外膜均發生改變,其中,外膜在血管功能和結構的調節中起著關鍵作用[10]。在PAH血管重構的過程中,PAFs作為血管外膜最主要的細胞類型能被多種途徑激活,進而出現過度增殖、抗凋亡、促炎和代謝異常等表型[3]。此外,在一些血管活性物質和細胞因子的作用下,活化的PAFs可轉化為肌成纖維細胞,肌成纖維細胞能表達α-SMA等收縮相關的骨架蛋白而具備收縮力,可遷移至中膜甚至內膜促進血管壁增厚。肌成纖維細胞還可以分泌收縮分子、細胞外基質(ECM)、生長因子等,從而在PAH肺血管增殖性重構中起重要作用[11-13]。

5-HT作為調節細胞增殖和遷移過程的眾多血管活性物質之一,是參與PAH形成和發展的重要分子。既往研究發現,5-HT能夠促進腎小球系膜細胞的增殖并激活纖維化信號通路,還能激活心肌成纖維細胞并誘導其增殖和遷移[14,15]。本課題組以往的研究表明5-HT可促進肺動脈平滑肌細胞增殖[16]。

與對照組比較,**P<0.01;與5-HT組比較,##P<0.01圖3 5-HT及5-HT2A受體拮抗劑、5-HT2A受體激動劑對PAFs細胞中α-SMA、CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表達的影響Figure 3 Effect of 5-HT and 5-HT2A receptor antagonist,5-HT2A receptor agonist on the expression of α-SMA, CTGF, Col-Ⅰ and Fn protein in PAFs

本研究使用5-HT處理PAFs顯示細胞的OD值、遷移細胞數顯著升高,提示5-HT可以促進PAFs的增殖和遷移。此外,5-HT干預的PAFs,α-SMA蛋白的表達顯著增加,提示5-HT刺激PAFs發生了表型轉化。CTGF是一種屬于CCN家族的細胞因子,具有促進成纖維細胞分裂、增殖、分化、遷移和合成細胞外基質等多種功能[17],并被證實參與多種組織器官的纖維化過程。纖連蛋白(Fn)、膠原是ECM的主要構成組分,其表達增多會影響血管結構和功能,成為血管重構的重要原因。在PAH血管重構中,外膜ECM中膠原蛋白、纖連蛋白和肌腱蛋白C等顯著增加[18]。本研究結果顯示,與對照組相比,5-HT干預的PAFs中CTGF、Col-Ⅰ和Fn蛋白表達水平均顯著升高,提示5-HT可增加促纖維化因子生成,促進ECM成分的分泌合成,增加ECM重塑。

5-HT2A受體是一種G蛋白偶聯受體,5-HT與其結合后可以激活細胞內一系列的信號通路,調節細胞的生理活性。既往認為,5-HT2A受體主要通過促進肺動脈收縮參與PAH。但也有研究顯示,5-HT2A受體拮抗劑可以預防MCT誘導的肺動脈壓力升高和肺血管結構重構,提示5-HT2A受體除了促進肺動脈收縮外,還參與了PAH肺動脈重構[19]。本課題組既往動物實驗也證實了這一點[8]。而本研究進一步在細胞水平上證實5-HT2A受體參與肺血管重構。本研究觀察到,5-HT2A受體激動劑能夠模仿5-HT的作用促進PAFs的增殖、遷移、表型轉化和細胞外基質合成,而5-HT2A受體拮抗劑則可以抑制5-HT誘導的PAFs增殖、遷移、表型轉化和細胞外基質合成,提示5-HT2A受體參與了5-HT對PAFs的激活作用。在5-HT與大鼠血管平滑肌細胞關系的研究中,給予5-HT2A受體阻斷劑后,肺動脈平滑肌細胞的增殖受到抑制,且抑制程度與5-HT2A受體阻斷劑的水平密切相關,呈劑量依賴性[20]。我們課題組前期研究也證實,5-HT2A受體激動劑抑制PASMCs凋亡,5-HT2A受體拮抗劑還可以預防5-HT誘導的PASMCs凋亡減少,提示5-HT2A受體還參與了5-HT抑制PASMCs凋亡[7]。

綜上所述,5-HT2A受體參與了5-HT對肺動脈成纖維細胞增殖、遷移的促進作用及對PAFs的激活作用。該結果進一步揭示了5-HT及5-HT2A受體在PAH發生中的作用,也為PAH治療提供了新的治療靶點和方向。