BMP4蛋白及其受體在不同發育期大鼠胃腸道的表達分布

孟憲博,林 強,韓士舉,梁世洋,王景杰

(空軍軍醫大學唐都醫院消化內科,西安 710038;*通訊作者,E-mail:jingjie@fmmu.edu.cn)

骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是轉化生長因子β(transforming growth factor-β)蛋白超家族成員,與骨和軟骨形態發生、修復相關[1]。隨著研究的進展發現,BMP除參與骨形態發生調節外,還參與諸多骨外組織的發育分化及功能維持[2],其中BMP4在消化道發育、組織分化和功能維持中起到重要作用[3,4]。但目前關于BMP4及其受體在不同發育階段大鼠消化道分布表達尚不清楚,對于其在不同消化道器官功能維持和分化發育的作用機制仍不明確。

前期研究表明,在胚胎消化道發育過程中,BMP4協同Hedghog通路相關蛋白參與消化道環形肌和縱行肌分化發育,且對于正常胚胎發育不可或缺[3]。除參與胚胎消化器官發育外,出生后正常消化器官穩態的維持同樣有BMP信號的參與調節,在炎癥、腫瘤和其他消化道疾病的影響下可能會產生BMP表達和分布異常[5-7]。有臨床研究表明,在許多消化道疾病和消化道腫瘤中,BMP4呈現出異常的表達水平和分布特點[2]。有研究報道BMP4與食管腺癌的發生密切相關,且BMP4基因突變與結直腸癌的發生同樣具有很高的相關性[8]。

因此,我們推測不同發育階段大鼠消化道器官中BMP4及其受體可能有分布和表達的差異性,或與正常消化道黏膜腺體及平滑肌功能維持密切相關。

為此本研究擬通過形態學和分子生物學方法,研究BMP4及其受體BMPR1B在不同發育階段大鼠消化道中的表達分布情況,特別關注BMP4在不同發育階段的表達差異,進而探討BMP4在胃腸發育調節以及胃腸疾病中的意義。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

5日齡、3周齡及8周齡雄性SD大鼠各6只,SPF級。5日齡大鼠體質量10-12 g,3周齡大鼠體質量50-60 g,8周齡大鼠體質量250-300 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2016-0011。

1.2 主要試劑、儀器

兔抗BMP4抗體(美國Abcam公司),兔抗BMPR1B抗體(美國Abcam公司),Alexa Fluor 594標記驢抗大鼠IgG抗體(美國Jackson公司),Alexa Fluor 488標記驢抗兔IgG抗體(美國Jackson公司),HRP酶標記的羊抗兔IgG抗體(美國Santa Cruz公司),HRP酶標記的羊抗小鼠IgG抗體(美國Santa Cruz公司),小鼠抗GAPDH抗體(中國Servicebio);Nikon eclipse Ci熒光顯微鏡(日本NIKON公司);冷凍切片機(德國Leica公司);電泳儀和電泳槽(美國Bio-Rad公司)。

1.3 胃腸道組織標本制備

用異氟烷誘導麻醉大鼠并維持,打開胸腔用預冷0.01 mol/L PBS溶液灌流心臟,打開腹腔觀察肝葉褪色后取胃、十二指腸及結腸用0.01 mol/L預冷PBS反復沖洗。分別將用于Western blot沖洗干凈后的胃、十二指腸和結腸組織剪碎,加入含蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,勻漿器勻漿,冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心15 min,吸取上清,用BCA法蛋白定量。用于免疫熒光的8周齡大鼠消化道組織4%多聚甲醛固定各節段消化道組織6-8 h,將固定好的組織置于25%蔗糖溶液,4 ℃浸泡過夜脫水沉底,包埋后冰凍切片機上連續切片,切片厚10 μm。

1.4 間接免疫熒光法檢測大鼠胃腸道BMP4及BMPR1B分布

將制備好的8周齡大鼠胃體、結腸升段組織冰凍切片，用含1% BSA+0.5%Triton的PBS液封閉40 min，加一抗(BMP4抗體按1 ∶100稀釋，α-SMA抗體按1 ∶200稀釋)。一抗4 ℃孵育過夜。經PBST漂洗5 min×3次，后加二抗(Alexa Fluor 488熒光標記二抗或，Alexa Fluor 594熒光標記二抗均按1 ∶1 000稀釋)室溫孵育2 h，DAPI工作液室溫孵育5 min襯核。PBST漂洗后，50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察染色后的胃體及結腸升段組織切片。

1.5 Western blot檢測大鼠胃腸道BMP4及BMPR1B相對表達水平

對5日齡、3周齡、及8周齡的大鼠用Western blot法半定量檢測胃、十二指腸、結腸組織BMP4及BMPR1B蛋白表達水平，取制備好的大鼠胃體、十二指腸及升結腸蛋白，絕對定量后用含蛋白酶及磷酸酶抑制劑的RIPA調整蛋白濃度至一致。分別加入loading buffer，金屬浴95 ℃ 10 min。對制備好的蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳、常規轉膜。將轉好的PVDF膜，用TBST配制的5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，封閉后TBST洗膜10 min×3次，再加兔抗BMP4/BMPR1B抗體(按1 ∶1 000稀釋)4 ℃孵育過夜。TBST漂洗15 min×2次。加HRP酶標記的羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h。TBST漂洗后，進行ECL化學發光反應。

1.6 統計學分析

Western blot條帶灰度值用Image pro plus軟件測量,并用SPSS21.0統計軟件進行單因素方差分析,Bonferroni法進行多個樣本均數間多重比較,P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMP4陽性細胞在胃腸道的組織分布特點

采用間接免疫熒光方法雙標α-SMA蛋白與BMP4蛋白,結果顯示:BMP4廣泛分布于8周齡大鼠胃及結腸全層。

胃腺體、黏膜肌層及肌層均可見大量BMP4分布,而黏膜下層未見明顯BMP4分布。相較于胃腺體,黏膜肌層及肌層BMP4分布更加廣泛,且在胃體外層縱行肌與中層環形肌交界處BMP4分布相對更加聚集(見圖1)。

A.胃體BMP4分布(紅);B.胃體平滑肌細胞(α-SMA標記,綠);C,D.BMP4和α-SMA雙標圖1 8周齡大鼠胃體BMP4分布特點Figure 1 Distribution of BMP4 in stomach of 8-week old rats

在結腸中,BMP4蛋白多在分泌后聚集于平滑肌層,黏膜層可見腺體細胞中由少量BMP4蛋白聚集,黏膜下層未見明顯染色。在結腸升段平滑肌層可見環形肌及縱行肌中廣泛分布BMP4,且在環形肌和縱行肌交界處,BMP4分布更加密集(見圖2A-D)。

A.結腸升段BMP4分布(紅);B.結腸平滑肌細胞(α-SMA標記,綠);C,D.結腸BMP4和α-SMA雙標圖2 8周齡大鼠結腸升段BMP4分布特點Figure 2 Distribution of BMP4 in ascending colon of 8-week old rats

2.2 BMPR1B陽性細胞在胃腸道的組織分布特點

結果顯示:BMP4蛋白受體BMPR1B在8周齡胃體和結腸升段中均有分布,且在胃體和結腸升段分布呈現一定的特異性。

在胃體中,共標平滑肌α-SMA蛋白與BMPR1B可見,BMPR1B在胃體黏膜層腺體細胞中廣泛分布,黏膜下層未見明顯分布,肌層中散在分布BMPR1B。在胃體肌層中,外側縱行肌與中層環形肌交界處可見較多點狀分布BMPR1B(見圖3)。

在大鼠結腸升段中,雙標α-SMA蛋白與BMPR1B可見,黏膜層和結腸肌層中有BMPR1B分布,黏膜下層未見明顯染色。黏膜層中,BMPR1B多分布在黏膜腺體細胞,黏膜肌層未見明顯分布。結腸升段平滑肌層中可見平滑肌間散在分布BMPR1B(見圖4)。

A.胃體BMPR1B陽性細胞(紅);B.胃體平滑肌細胞(α-SMA標記,綠);C,D.胃體BMPR1B和α-SMA雙標圖3 大鼠胃體BMPR1B分布特點Figure 3 Distribution of BMPR1B in stomach of rats

A.結腸BMPR1B陽性細胞(紅);B.結腸平滑肌細胞(α-SMA標記,綠);C,D.BMPR1B和α-SMA雙標圖4 大鼠結腸升段BMPR1B分布特點Figure 4 Distribution of BMPR1b in rat ascending colon

2.3 BMP4在胃腸道的時空表達特點

結果示BMP4在胃、十二指腸、結腸均有表達。

5日齡、3周齡與8周齡大鼠胃體中BMP4蛋白表達水平差異有統計學意義(F=23.6,P<0.05),且5日齡、3周齡大鼠胃體中BMP4表達水平分別高于8周齡(P<0.05)。5日齡和3周齡大鼠十二指腸BMP4表達水平分別高于8周齡大鼠,差異有統計學意義(P<0.05),而5日齡與3周齡大鼠結腸中BMP4表達水平未見明顯差異(P>0.05),但表達水平與8周齡大鼠相比差異有統計學意義(F=58.0,P<0.05)。

對于同一發育階段大鼠,胃、十二指腸與結腸BMP4表達水平差異有統計學意義(F5 d=40.2,P<0.05;F3周=93.8,P<0.05;F8周=13.3,P<0.05)。在5日齡和3周齡大鼠中,胃體與十二指腸BMP4表達水平均高于結腸,差異有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

2.4 BMPR1B在胃腸道的時空表達特點

結果示BMPR1B在胃、十二指腸、結腸均有表達(見圖6)。

對于不同發育階段大鼠,3周齡大鼠胃體BMPR1B表達水平高于5日齡及8周齡大鼠,差異有統計學意義(P<0.05),且3周齡大鼠十二指腸BMPR1B表達水平同樣高于5日齡及8周齡大鼠,差異有統計學意義(P<0.05)。5日齡、3周齡與8周齡大鼠結腸BMPR1B表達水平差異有統計學意義(F=45.1,P<0.05)。

對于同一發育階段大鼠不同消化道部位,3周齡與8周齡大鼠胃體BMPR1B表達水平均高于結腸,差異有統計學意義(P<0.05)。5日齡大鼠胃體、十二指腸與結腸BMPR1B表達水平差異有統計學意義(F=38.4,P<0.05)。

3 討論

骨形態發生蛋白屬于轉化生長因子β家族,包含20種結構類似的蛋白[9]。在細胞增殖、分化和凋亡過程中,骨形態發生蛋白家族起到至關重要的作用,如敲除BMP2/4基因對于小鼠胚胎來說具有致死性[4,10]。BMP通過與其受體結合,形成Ⅰ/Ⅱ型絲蘇氨酸激酶受體。Ⅰ型和Ⅱ型受體結構類似,不同的BMP蛋白較為特異地選擇結合不同類型的BMP受體。激活受體后,BMP通過經典通路或非經典通路磷酸化下游Smad1/5/8蛋白,參與細胞內信號轉導[11],同時與其他信號通路間同樣存在交流[12,13]。

與5日齡比較,*P<0.05;與3周齡比較,△P<0.05;與胃體比較,#P<0.05;與十二指腸比較,▲P<0.05圖5 BMP4蛋白在不同發育階段大鼠胃、十二指腸、結腸的表達水平差異Figure 5 Expression of BMP4 protein in stomach, duodenum and colon of rats with different developmental stages

與5日齡比較,*P<0.05;與3周齡比較,△P<0.05;與胃體比較,#P<0.05;與十二指腸比較,▲P<0.05圖6 BMPR1B蛋白在不同發育階段大鼠胃、十二指腸、結腸的表達水平差異Figure 6 Expression of BMPR1B protein in stomach, duodenum and colon of rats with different developmental stages

臨床研究提示,骨形態發生蛋白家族參與糖尿病諸多并發癥的發生發展[14],如促進視網膜病變、心血管病變和糖尿病腎病等并發癥的發展[15-17]。BMP4在炎癥、腫瘤和其他消化道疾病發生發展的過程中,表達和分布發生特定的變化[2,5],在多種消化道及其他組織的腫瘤相關研究中發現BMP4具有促進腫瘤發生及侵襲轉移的潛能,如肝細胞肝癌中高表達BMP4增強了腫瘤的侵襲性而其在胰腺癌中卻表現出雙相作用的特點[8,18]。在消化道疾病中,腸功能紊亂、內環境平衡破壞時,諸如炎癥反應、動力紊亂及腫瘤發生等病理狀態,異常表達的BMP4對于平滑肌功能可能存在抑制性調控作用,提示其參與胃腸穩態和動力的維持。本研究結果提示,BMP4及其受體BMPR1B在不同發育階段大鼠的胃體、十二指腸和結腸中,廣泛表達且表達水平和分布呈現一定的時空差異性。在胚胎消化道形成過程中,骨形態發生蛋白作為重要調節因素參與器官分化形成,在胚胎發育不同階段,BMP4蛋白呈現差異性表達,且參與原腸組織分化與消化道各節段形成。在小鼠胚胎早期,諸如WNTs、FGFs、NOTCH、Hedgehog通路和BMP信號通路等均參與到早期消化道形成過程中[19-22]。在這其中,BMP信號通路直接調節或者間接與其他信號通路作用,調控內胚層的分化[17]。而BMP信號異常會導致許多器官發育不健全,如慢性腎病、成骨不全、骨關節炎、肺動脈高壓、遺傳性出血性毛細血管擴張癥、Barrett食管、幼年息肉病等。大鼠出生后早期不能獨立進食,消化道功能尚未完全成熟,隨著3周齡大鼠能夠獨立進食,這種攝食行為的改變促使其胃體、十二指腸及結腸的功能逐漸完善成熟,與3周齡及8周齡大鼠十二指腸及結腸BMP4蛋白表達相較于5日齡大鼠差異性表達可能相關。這進一步提示在大鼠出生后BMP4的時間差異性表達可能參與胃體、十二指腸及結腸組織功能維持及分化過程。

形態學結果提示,BMP4蛋白主要由消化道上皮及腺體細胞分泌,其受體BMPR1B主要在黏膜層,消化道肌層散在分布。BMP4的這種分泌特點決定其不僅作用于分泌細胞本身,也對臨近細胞及平滑肌細胞產生影響。在胃體免疫熒光雙標染色可見,BMPR1B在黏膜層大量分布,肌層散在分布。在結腸升段中,BMP4受體主要分布在黏膜層,平滑肌層散在分布。在胚胎腸道發育階段,BMP4協同Hedghog通路相關蛋白參與消化道環形肌和縱行肌分化,而在出生后不同階段的差異表達和分布特點提示BMP4參與胃體及結腸平滑肌正常功能的維持。

綜上,BMP4蛋白除在胚胎發育階段對消化道形成分化起調控作用,在大鼠出生后腸道功能完善及維持的過程中,BMP4可能也起到重要作用。BMP4不僅參與正常組織細胞功能維持和分化,也參與消化道疾病的發生發展調控,因此對其在不同發育階段大鼠消化道中的分布表達研究具有一定的臨床提示意義。本研究通過研究BMP4及其受體在大鼠不同發育階段胃腸道分布表達特點并結合既往研究結果,為研究胃腸炎性疾病以及胃腸道腫瘤提供新的潛在靶點。