諾如病毒病毒樣顆粒疫苗免疫小鼠誘導的體液和黏膜免疫應答

劉悅越,趙榮榮,趙一榮,張韻祺,杜加亮

(1中國食品藥品檢定研究院呼吸道病毒疫苗室,北京 102629;2云南大學數學與統計學院;3中國食品藥品檢定研究院單克隆抗體產品室;*通訊作者,E-mail:dujialiang@nifdc.org.cn)

諾如病毒(Norovirus,NoV)是全球非細菌性胃腸炎暴發的最重要病因[1],可引起低齡兒童、老年人和慢性病患者嚴重脫水,導致住院甚至死亡[2],造成沉重的社會經濟負擔。世界衛生組織(World Health Organization,WHO)強調NoV是疫苗開發的優先事項。然而,用于諾如病毒培養的動物或細胞模型的缺乏阻礙了疫苗的發展。NoV主要衣殼蛋白VP1具有自組裝能力,可形成無遺傳物質的病毒樣顆粒(virus like particle,VLP),其在形態和抗原上類似于天然病毒[3]。已有研究表明,人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)[4]、流感病毒[5]、腸道病毒71[6]等的VLP候選疫苗具有安全性、免疫原性和有效性,HPV VLP疫苗的上市許可證明了VLP作為疫苗抗原的可行性。因此,VLP成為目前諾如病毒疫苗研發領域中理想的疫苗抗原。

根據病毒VP1基因序列差異,NoV可被分為10個基因組(GⅠ-GⅩ),其中GⅠ和GⅡ基因組是引起胃腸炎暴發的主要原因[7],而GⅡ.4毒株是全球流行的主要基因型,造成50%-70%的暴發[8]。我國的GⅠ.1/GⅡ.4型二價NoV疫苗正在臨床開發中。有研究表明,漢遜酵母表達的重組NoV GⅠ.1和GⅡ.4型VLP可產生較強的免疫反應[9]。了解疫苗接種后抗體水平的變化規律,對合理評價疫苗的免疫效果至關重要。本研究旨在通過血清型特異性IgG、IgM、IgA、組織血型抗原(histoblood group antigen,HBGA)阻斷抗體和糞便IgA等指標探索NoV GⅠ.1/GⅡ.4 VLP候選疫苗在BALB/c小鼠體內的抗體應答。

1 材料和方法

1.1 疫苗

重組二價諾如病毒疫苗由國藥中生生物技術研究院有限公司提供,為GⅠ.1和GⅡ.4兩種基因型的NoV VP1組成的類病毒顆粒,每劑0.5 ml,含GⅠ.1和GⅡ.4型VP1蛋白各50 μg。

1.2 實驗動物

無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雌性BALB/c小鼠,7周齡,18-22 g,購自中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心,動物許可證號SCXK(京)2017-0005。

1.3 主要試劑

中性親和素包被微孔板購自Thermo Scientific公司,酶標板購自美國costar公司,H(3型)-PAA-生物素和Leb-PAA-生物素購自Glycotech公司,GⅠ.1型和GⅡ.4型NoV VLP由國藥中生生物技術研究院有限公司提供,GⅠ.1型、GⅡ.4型特異性抗體購自英國Abcam公司,HRP標記的羊抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA購自美國Invitrogen公司,TMB購自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 實驗分組及免疫

將20只BALB/c小鼠隨機分為2組,每組10只。疫苗組每只小鼠接種0.1 ml二價諾如病毒疫苗,含GⅠ.1和GⅡ.4型VP1蛋白各10 μg及0.08 mg氫氧化鋁佐劑,對照組接種0.1 ml氫氧化鋁佐劑(0.08 mg),免疫程序為第0,21天免疫。首次免疫后第7,14,21,28,35天,小鼠內眥采血,分離血清-20 ℃保存,首次免疫第7,14,21,28天采集每組小鼠糞便,-20 ℃保存,實驗時用PBS以10%(W/V)比例制備糞便混懸液,2 300g離心10 min,取上清。

1.5 NoV型特異性血清IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA分析

采用酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)測定血清中NoV型特異性IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA[10]。分別用1 μg/ml GⅠ.1型和GⅡ.4型VLP包被96孔酶標板,4 ℃過夜。洗板后每孔加入200 μl含2% BSA的PBS封閉液,4 ℃過夜。將200倍稀釋的血清加入酶標板中,37 ℃孵育1 h。洗板后分別加入HRP標記的羊抗鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgM、IgA,其中IgG、IgG1、IgG2a、IgA均為1 ∶6 000稀釋,IgM為1 ∶3 000稀釋,37 ℃孵育1 h。洗板后加入TMB底物20-25 ℃避光顯色15 min,終止液終止反應后酶標儀450/630 nm讀板。以陰性對照小鼠血清孔的光密度值(optical density,OD)均值+3×標準差(standard deviation,SD)為臨界值,如低于0.1,則以0.1為臨界值,血清樣品的OD值≥臨界值即為陽性。

1.6 NoV型特異性血清和糞便IgA水平定量測定

采用ELISA測定血清和糞便中NoV型特異性IgA水平。實驗方法同1.5。其中血清以200倍稀釋起,糞便以10倍稀釋起,2倍系列稀釋后進行測定。抗體效價定義為OD值高于臨界值的血清或糞便的最高稀釋度,陰性樣品的抗體效價計為起始稀釋度的50%,即陰性血清樣品IgA效價計為100,陰性糞便樣品IgA計為5。

1.7 HBGA阻斷試驗

通過HBGA阻斷試驗測定血清中的GⅠ.1和GⅡ.4型抗體的HBGA阻斷效價[11]。分別用2.5 μg/ml的Leb-PAA-生物素和H(3型)-PAA-生物素包被中性親和素包被微孔板。將首次免疫第28天的小鼠血清100倍起2倍系列稀釋,疫苗組稀釋至12 800倍,對照組稀釋至800倍,分別與GⅠ.1型和GⅡ.4型VLP混合,設立稀釋液與VLP混合的對照,37 ℃孵育1 h。將混合物加至HBGA包被的微孔板中,4 ℃孵育2 h。洗板后,加入GⅠ.1型、GⅡ.4型特異性抗體,37 ℃孵育1 h。洗板后加入HRP標記的羊抗鼠IgG,37 ℃孵育1 h。洗板后加入TMB底物20-25 ℃避光顯色15 min,終止液終止反應后酶標儀450/630 nm讀板。抗體的阻斷指數(%)=100%-(血清孔OD值/對照孔OD值)×100%。阻斷效價50(blocking titer 50,BT50)表示為阻斷50% VLP結合的血清最高稀釋度的倒數,即為血清抗體阻斷病毒與HBGA受體或附著因子結合的能力。

1.8 統計學分析

采用SPSS 23.0軟件對血清各型抗體進行統計分析。通過重復測量資料的方差分析統計疫苗組與對照組間各型抗體及疫苗組各型抗體不同時間點間的差異,如數據不滿足球形假設,則用Greenhous-Geisser方法進行校正。將血清IgA抗體濃度進行對數轉換后,通過重復測量資料的方差分析統計疫苗組與對照組間血清IgA水平的差異,并采用配對t檢驗進行疫苗組內不同時間點的抗體水平差異分析,如差值不符合正態分布,采用兩相關樣本的非參數檢驗,顯著性水平為0.05。

2 結果

2.1 血清NoV型特異性抗體

疫苗組小鼠第1劑免疫后第7天即產生NoV型特異性IgG、IgG1和IgG2a,至第35天一直維持在較高水平。IgM在第1劑免疫后第7天升至高水平,之后逐漸降低,IgA在第2劑免疫后第7天明顯升高(見圖1,2)。

圖1 疫苗組和對照組小鼠血清NoV GⅠ.1型特異性抗體反應Figure 1 Serum NoV GⅠ.1-specific antibody response in vaccine group and control group

通過重復測量資料的方差分析,疫苗組與對照組間各型抗體差異均有統計學意義(P<0.01)。疫苗組不同時間點的抗體,除GⅠ.1型IgG和IgG1差異無統計學意義外,其他均有統計學意義(GⅠ.1型IgG2a:P<0.05;GⅠ.1型IgM、IgA和GⅡ.4型各抗體:P<0.01)。

2.2 免疫后血清NoV IgA水平

疫苗組在第1劑接種后第28天即第2劑接種后第7天血清特異性IgA達到較高水平,對照組均為陰性,疫苗組首劑接種后第28天和第35天的各型血清IgA抗體水平差異均無統計學意義(見表1)。疫苗組與對照組間血清IgA水平差異有統計學意義(P<0.01)。

表1 疫苗組免疫后血清IgA水平差異分析 (log2效價,Table 1 The difference analysis results of serum IgA levels after immunization in vaccine

圖2 疫苗組和對照組小鼠血清NoV GⅡ.4型特異性抗體反應Figure 2 Serum NoV GⅡ.4-specific antibody response in vaccine group and control group

2.3 免疫后糞便NoV IgA水平

疫苗組在第1劑免疫后第7天糞便IgA轉陽,第21天糞便IgA水平略有下降,第28天再次升高,疫苗組糞便GⅠ.1型IgA達到160,GⅡ.4型IgA達到80(見圖3)。

圖3 疫苗組和對照組糞便NoV GⅠ.1和GⅡ.4型特異性IgA抗體水平Figure 3 Fecal titers of NoV GⅠ.1- and GⅡ.4-specific IgA antibodies in vaccine group and control group

2.4 免疫后血清HBGA阻斷抗體水平

通過HBGA阻斷試驗進一步分析第28天,即第2劑免疫后第7天的小鼠血清抗體阻斷活性。結果顯示,疫苗組各型血清均有阻斷活性(見圖4),血清GⅠ.1型BT50達到400,GⅡ.4型BT50達到800。

圖4 疫苗組和對照組免疫后第28天血清HBGA阻斷抗體水平Figure 4 Levels of serum HBGA blocking antibodies at day 28 after the first immunization in vaccine group and control group

3 討論

NoV是全球流行性非細菌性胃腸炎的主要原因,多種候選NoV疫苗正在研發或臨床階段。由于NoV GⅠ和GⅡ基因組間無交叉保護性免疫應答[12],我國研究者以NoV GⅠ.1型和GⅡ.4型病毒株VLP組成二價疫苗,旨在提供廣泛的保護作用。為了初步評價該疫苗的免疫原性,本研究觀察了GⅠ.1和GⅡ.4諾如病毒VLP抗原在小鼠體內的體液、黏膜和中和抗體應答。

與Tamminen等[13]的VLP研究結果一致,本研究中小鼠接種1劑重組諾如病毒疫苗后,即產生較高的抗體反應,尤其是GⅠ.1型IgG,GⅡ.4型的IgG也呈現逐漸升高的趨勢,表明VLP蛋白具有較強的免疫原性,能夠誘導機體產生免疫反應。此外,作為細胞反應標志物的IgG亞類分析表明,各型抗原都會產生IgG1和IgG2a反應,提示誘導抗原特異性Th2/Th1型反應,前者參與調節抗病毒細胞免疫,后者增強體液免疫反應。據報道EV71 VLP也可刺激免疫小鼠產生混合Th1和Th2型反應[14],本研究結果顯示,第2次免疫后血清IgA抗體滴度增加至較高水平,表明重復疫苗接種有效地增強NoV衣殼特異性血清抗體反應。在糞便樣品中也觀察到IgA反應,提示抗原激活機體黏膜免疫系統。黏膜免疫產生的IgA抗體能夠抑制病毒黏附于腸道黏膜表面,對某些抗原物質具有封閉作用。與諾如病毒相似,輪狀病毒也是感染腸道表面,有證據表明,針對輪狀病毒的局部黏膜免疫反應對于抵抗病毒感染至關重要,血清和糞便IgA抗體與防止輪狀病毒再感染有關[15]。由于兩種病毒的感染途徑相似,推測NoV特異性IgA可能也與機體抵御病毒感染的保護作用有關。較高的GⅡ.4特異性血清IgA抗體水平與受試者中NoV感染和患病率的降低有關[16]。然而,在一項GⅠ.1型NoV的攻擊研究中,病毒特異性血清IgA水平與相應型別疾病的保護無關,但較高的病毒特異性唾液IgA抗體水平可降低諾如病毒胃腸炎的風險[17],提示腸黏膜免疫可能對諾如病毒胃腸炎起保護作用。

由于NoV體外培養系統和動物模型尚不成熟,因此無法采用常規的病毒中和試驗測定抗體中和效價。HBGA在人體分泌物中和黏膜表面表達,諾如病毒可通過VP1突出的P2結構域與HBGA的糖基相結合,進入胃腸道上皮細胞。NoV特異性抗體可阻斷NoV VLP與其HBGA受體或附著因子的結合,研究表明阻斷NoV VLP與HBGA結合的抗體可能與保護作用有關,因此學者們公認將血清HBGA阻斷抗體作為中和抗體的替代指標[18],其成為諾如病毒的免疫保護性標志物。為了探索二價NoV疫苗誘導免疫的功能,確認其抗體在中和方面的保護潛力,本研究測定抗原免疫后第28天的血清HBGA阻斷抗體水平,疫苗組血清GⅠ.1型和GⅡ.4型BT50分別不低于400和800。有學者在人群中研究HBGA阻斷抗體水平與保護作用之間的關系,結果GⅠ.1型血清HBGA阻斷效價≥200與對諾如病毒引起的疾病的有效保護有關[19],GⅡ.4型血清HBGA阻斷效價≥500與對諾如病毒導致的中至重度嘔吐或腹瀉的預防相關[16],提示該疫苗可誘導機體產生阻斷抗體,為機體提供有效的保護作用。

本研究基于小鼠免疫接種試驗,結果提示重組NoV VLP疫苗通過誘導針對GⅠ.1和GⅡ.4型的保護性免疫反應在小鼠中具有較好的免疫原性,可能為人體諾如疫苗免疫后的反應評價研究提供參考。