C57BL/6小鼠關節軟骨細胞的提取及凋亡模型的建立

余真妍,楊洪賓,紀帥帥,劉 陽,霍 強*

(1蚌埠醫學院藥學院藥物化學教研室,蚌埠 233030;2南京醫科大學藥學院藥劑學教研室;*通訊作者,E-mail:620793985@qq.com)

骨關節炎是一種嚴重影響患者生活質量的關節退行性疾病[1],發病因素多,過程復雜,致病機制至今仍未知[2]。雖然發病機制尚不明確,但是越來越多的證據表明軟骨細胞的活化及其失調與骨關節炎的發病機制密切相關[3]。軟骨細胞是在軟骨中發現的唯一一種細胞,其具有生成和維持膠原和蛋白聚糖等軟骨基質的功能。在關節軟骨破壞過程中,軟骨細胞是分泌炎性因子的主要細胞[4],但是軟骨細胞體外增殖能力有限,容易去分化失去原有表型。目前關于關節軟骨細胞的分離及體外培養主要見于人[5]、兔[6]、大鼠[7]、豬[8]等,而對于來源于C57BL/6小鼠的軟骨細胞培養報道較少。同時,近年來大量研究表明軟骨細胞凋亡與骨關節炎的發病密切相關[9]。基于骨關節炎課題研究的需要,我們采用兩步酶消化配合機械吹打法從C57BL/6小鼠關節中提取得到高活力的軟骨細胞,并采用經典凋亡誘導劑星形孢菌素(staurosporine,STS),構建軟骨細胞凋亡模型,為骨關節炎藥物的開發提供可參考的實驗方法。

1 材料與方法

1.1 材料

C57BL/6小鼠10只,SPF級,15-18 g,雄鼠,由常州卡文斯實驗動物有限公司提供;星形孢菌素購自阿拉丁試劑(上海)有限公司;胎牛血清購自浙江天航生物科技有限公司;0.25%胰蛋白酶、DMEM低糖培養基購自美國Gibco公司;4%多聚甲醛固定液、甲苯胺藍購自上海麥克林生化科技有限公司;Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司;增強型CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司;凋亡試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司;牛血清白蛋白、Ⅱ型膠原兔多克隆抗體、Cy3標記山羊抗兔lgG、DAPI、Annexin Ⅴ-FITC/PI試劑盒、引物、RNA提取液、RT First Strand cDNA Synthesis Kit、2×SYBR Green qPCR Master Mix購自武漢賽維爾生物科技有限公司;超凈工作臺購自德國Heraeus公司;二氧化碳培養箱購自日本Sanyo公司,LX-800酶標儀購自美國Bio-tek公司;倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司;IX71倒置熒光顯微鏡購自日本Olympus公司;熒光定量PCR儀購自伯樂生命醫學產品(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠關節軟骨細胞的分離、提取和培養 將10只15-18 g C57BL/6小鼠頸椎脫臼處死后,75%酒精浸泡5 min,用手術刀將皮膚切開,沿髕骨下緣打開關節囊,切斷髕韌帶、內外副韌帶及前后交叉韌帶,離斷膝關節,去除股骨和脛骨表面的結締組織。用手術刀將各個肢體軟骨層約1/2削下,盡量削薄,放在含雙抗的PBS培養皿中,將取下的軟骨組織剪成1 mm×1 mm的小碎片,移至15 ml離心管中,使用含雙抗的PBS沖洗兩遍,洗去軟骨表面的血液及滑膜組織。加入3倍體積的0.25%胰蛋白酶,放入37 ℃,5% CO2培養箱消化20 min。加入培養基終止消化,1 500 r/min,離心5 min,棄上清,加入0.2% Ⅱ型膠原酶重懸后,放至37 ℃,5% CO2培養箱中消化8 h,中途每隔2 h拿出來,在超凈臺上用巴氏吸管吹打2 min,使膠原酶與軟骨組織充分接觸。加入DMEM完全培養基終止消化,反復吹打后過200目濾網,收集濾液,1 500 r/min,離心5 min,棄上清,用DMEM完全培養基重懸后放入37 ℃,5% CO2培養箱中。如剩余的軟骨組織呈團塊狀,未呈現出透明纖維狀,可再加入0.2% Ⅱ型膠原酶繼續消化,但確保消化時間不能超過12 h,否則過度消化會影響軟骨細胞的活性。24 h后初次換液,之后每隔兩天換液一次,待細胞長到80%以上時進行傳代,傳代時加入0.25%胰蛋白酶消化,顯微鏡下觀察細胞消化狀態,待細胞變圓變亮且漂浮在溶液中時,加入與胰蛋白酶等體積的完全培養基終止消化,巴氏吸管吹打制成單細胞懸液,離心后重懸,按1 ∶3傳代培養。顯微鏡下觀察軟骨細胞貼壁生長情況,拍照記錄前5代軟骨細胞形態變化。

1.2.2 甲苯胺藍染色鑒定C57BL/6小鼠關節軟骨細胞 將軟骨細胞接種于六孔板中,每孔待細胞長滿到80%后,傾去培養液,PBS清洗3次,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min。傾去4%多聚甲醛溶液,PBS清洗3次,加入75%的乙醇固定30 min。傾去75%的乙醇溶液,PBS清洗3次,晾干。加入0.1%甲苯胺藍染色20 min。PBS清洗3次,無水乙醇再迅速清洗1次。晾干,顯微鏡下觀察,拍照。

1.2.3 Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定C57BL/6小鼠關節軟骨細胞 將第3代C57BL/6小鼠關節軟骨細胞按照每孔2×104個細胞接種到放有爬片的六孔板中,待細胞長到約80%后,取出細胞爬片。PBS清洗3次,4%多聚甲醛固定30 min。PBS清洗3次,3% BSA室溫封閉30 min,輕輕甩掉封閉液,加入1 ∶200經PBS稀釋的一抗(Ⅱ型膠原),放于濕盒內4 ℃孵育過夜。PBS清洗3次,加入Cy3標記山羊抗兔(1 ∶300),避光室溫孵育50 min。PBS清洗3次,避光,滴加DAPI染液,避光室溫孵育10 min。PBS清洗3次,爬片晾干后用抗熒光淬滅封片劑封片,倒置熒光顯微鏡下觀察,拍照。

1.2.4 RT-PCR檢測C57BL/6小鼠關節軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA的表達 RT-PCR分別檢測5代C57BL/6小鼠關節軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA的表達情況。根據Trizol實驗說明提取總RNA,再根據反轉錄PCR說明書進行操作。反應體系在25 ℃反應5 min,42 ℃反應30 min,85 ℃反應5 s,完成cDNA的合成。PCR反應體系擴增目的基因及內參照β-actin,Ⅱ型膠原引物序列:上游5′-ACGCTACACTCAAGTCACTGAACAAC-3′,下游5′-TCAATCCAGTAGTCTCCGCTCTTC-3′;β-actin引物序列:上游5′-GTGACGTTGACATCCGTAAAGA-3′,下游5′-GTAACAGTCCGCCTAGAAGCAC-3′。PCR反應:95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火30 s,60 ℃延伸30 s,40個循環,每個循環結束后采集熒光,最后繪制熔解曲線。待測基因mRNA相對表達量以其擴增物的Ct值表示。

1.2.5 CCK-8法檢測C57BL/6小鼠關節軟骨細胞增殖情況 分別將傳代培養的5代C57BL/6小鼠軟骨細胞用0.25%胰蛋白酶消化,900 r/min,離心4 min,DMEM完全培養基重懸細胞制成單細胞懸液,以每孔2×103的密度分別均勻接種于9塊96孔板中,每塊板每代設置6個復孔。每隔兩天換一次液,連續9 d,每天固定時間點取出一塊96孔板加入10 μl的CCK-8試劑,37 ℃,5% CO2培養箱孵育2 h,酶標儀450 nm處測定各孔OD值,取平均值。

1.2.6 流式細胞儀檢測星形孢菌素對軟骨細胞促凋亡作用 Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色法檢測第3代軟骨細胞凋亡情況,軟骨細胞以2×104/ml接種于6孔板中,24 h后換為無血清培養基。在培養基中分別加入終濃度為0,5,10,20 μmol/L的星形孢菌素及200 μmol/L H2O2陽性對照刺激軟骨細胞24 h。細胞凋亡刺激后,先收集細胞培養上清,用不含EDTA的胰酶消化處理貼壁的細胞,用已收集的培養基上清終止消化,1 500 r/min,4 ℃離心5 min收集約1×105個細胞。用預冷的PBS清洗細胞2次,收集細胞。向收集的細胞中加入100 μl預冷的1×Binding Buffer,輕柔重懸細胞。向重懸細胞中加入5 μl Annexin Ⅴ-FITC和5 μl PI,輕柔混勻。室溫條件下避光反應10 min后,加入400 μl預冷的1×Binding Buffer,輕輕搖勻,1 h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

1.2.7 AOEB法檢測星形孢菌素對軟骨細胞促凋亡作用 為進一步驗證星形孢菌素對軟骨細胞的促凋亡作用,用吖啶橙/溴乙錠(AOEB)法檢測第3代細胞凋亡情況,將軟骨細胞分為正常組和10 μmol/L星形孢菌素作用組,用終濃度為10 μmol/L的星形孢菌素作用軟骨細胞24 h。收集細胞,PBS洗滌細胞2次,并配成2×105/ml細胞懸液,將AO與EB溶液等體積混勻,吸取25 μl的細胞懸液同1 μl的AO與EB混合液輕輕搖勻,吸取上述10 μl的混合液置于一干凈的載玻片上,并用蓋玻片蓋上細胞,熒光顯微鏡510 nm激發波長觀察細胞凋亡情況。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 C57BL/6小鼠關節軟骨細胞形態學特征

分離培養的原代C57BL/6小鼠關節軟骨細胞呈類圓形,懸浮于培養基中,大小均一,具有較強的折光性,倒置顯微鏡顯示,細胞在未貼壁前呈類球形,懸浮于培養基中,12 h內逐漸貼壁,貼壁細胞大多數呈圓形,24 h內基本貼壁,貼壁細胞大多數呈圓形或橢圓形,培養7 d后,原代細胞90%融合,胞體豐滿,胞質均勻,核大而圓,細胞緊密排列呈“鋪路石”狀外觀,此時的軟骨細胞為第1代(P1)。消化傳代后,6 h左右可完全貼壁,傳代后細胞增殖速度加快,4 d左右就可見90%細胞融合。細胞隨著培養時間的增加,逐漸分化。不同代數細胞呈現出不同的形態,由第1代的類圓形,第2代的三角形,到第3代的三角形及短梭形;3代后主要呈長梭形且形態不規則,胞核增大,胞質邊緣模糊化(見圖1)。隨著傳代次數增加,細胞中梭形細胞逐漸增多,傳代周期延長,鏡下細胞長而大,折光性差,部分細胞脫落,懸浮于培養液中。

圖1 不同代數C57BL/6小鼠關節軟骨細胞的形態變化Figure 1 Morphological changes of different generations of articular chondrocytes from C57BL/6 mouse

2.2 甲苯胺藍染色鑒定C57BL/6小鼠關節軟骨細胞

C57BL/6小鼠關節軟骨細胞第1,3,5代甲苯胺藍染色結果見圖2。第1,3,5代關節軟骨細胞經甲苯胺藍染色后,胞內呈藍色異染顆粒,胞核呈深藍色異染顆粒。并且隨著傳代數目的增加,細胞內的異染顆粒顏色逐漸變淺。因此,甲苯胺藍染色結果證明提取的細胞為軟骨細胞。

圖2 不同代數C57BL/6小鼠關節軟骨細胞甲苯胺藍染色結果Figure 2 Toluidine blue staining of different generations of articular chondrocytes from C57BL/6 mouse

2.3 Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定C57BL/6小鼠關節軟骨細胞

C57BL/6小鼠第3代關節軟骨細胞Ⅱ型膠原免疫熒光染色結果顯示,在細胞的細胞質中Ⅱ型膠原染色表達紅色熒光,細胞核經DAPI染色表達藍色熒光,圖片重合后藍色熒光位于紅色熒光內(見圖3)。因此,Ⅱ型膠原免疫熒光結果證明培養的細胞為軟骨細胞。

圖3 Ⅱ型膠原免疫熒光染色結果Figure 3 Immunofluorescence staining of type Ⅱ collagen

2.4 RT-PCR法檢測C57BL/6小鼠關節軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA表達情況

5代C57BL/6小鼠關節軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達情況見圖4。與第1代軟骨細胞相比,第2代和第3代軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA的相對表達量差異無統計學意義,而第4代和第5代軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA相對表達量顯著降低,差異有統計學意義(均P<0.001)。

與第1代(P1)軟骨細胞相比,***P<0.001圖4 不同代數軟骨細胞Ⅱ型膠原mRNA表達Figure 4 The mRNA expression of type Ⅱ collagen in chondrocytes of different generations

2.5 CCK-8法檢測C57BL/6小鼠關節軟骨細胞增殖情況

根據CCK-8法分別測定的5代C57BL/6小鼠關節軟骨細胞的細胞活力,繪制軟骨細胞生長曲線,結果見圖5。細胞的生長曲線呈S型,隨著培養天數的增加,3 d后細胞進入對數生長期,6 d后處于平臺期,細胞生長逐漸緩慢,7 d后細胞增殖能力開始呈下降趨勢。第4代和第5代軟骨細胞生長平緩,增殖高峰低,且這一變化隨著傳代次數增多愈加明顯,與第1代軟骨細胞相比,第4代和第5代軟骨細胞的細胞活力顯著降低,差異有統計學意義(均P<0.05,見圖5)。

2.6 流式細胞儀檢測星形孢菌素對軟骨細胞促凋亡作用

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染色流式結果見圖6。0,5,10,20 μmol/L星形孢菌素及H2O2分別作用軟骨細胞24 h后,細胞的凋亡率分別為(10.48±0.18)%,(42.97±2.02)%,(63.97±1.67)%,(64.52±2.55)%,(64.71±1.53)%。與H2O2組相比,0 μmol/L和5 μmol/L組凋亡率降低(均P<0.001),10 μmol/L和20 μmol/L組凋亡率差異無統計學意義。因此,10 μmol/L的星形孢菌素作用軟骨細胞24 h促凋亡最適宜。

與第1代(P1)軟骨細胞相比,*P<0.05圖5 不同代數C57BL/6小鼠關節軟骨細胞CCK-8檢測結果Figure 5 Growth curves of different generations of articular chondrocytes from C57BL/6 mice

圖6 流式細胞儀分析檢測軟骨細胞凋亡率Figure 6 Apoptosis of chondrocytes detected by flow cytometry

2.7 AOEB法檢測星形孢菌素對軟骨細胞促凋亡作用

吖啶橙/溴乙錠法(AOEB)軟骨細胞熒光顯微鏡觀察結果見圖7。正常組細胞核質體被吖啶橙(AO)均勻染成綠色,大小形狀單一,壞死細胞呈橢圓形,核質體被溴乙錠(EB)均勻染成橙色,大小形狀單一。星形孢菌素10 μmol/L組作用24 h,凋亡早期細胞核質體被AO均勻染成綠色,細胞形狀不規則,如新月形;凋亡晚期細胞,核質體被EB均勻染成橙色,染色質濃縮,細胞核碎裂成點狀,大小不一,可見胞質芽狀突起。

圖7 熒光顯微鏡觀察第3代軟骨細胞AOEB染色情況Figure 7 AOEB staining of the third generation chondrocytes under fluorescence microscope

3 討論

正常的軟骨是一種特殊的結締組織,其主要成分是軟骨細胞和基質,不含纖維血管組織[10]。體外培養軟骨細胞是研究正常軟骨細胞生物學特性及骨關節炎發病機制的重要手段。長久以來,由于人們認為軟骨細胞不具備分裂增殖的能力[11],所以未進行軟骨細胞體外培養研究。自1967年Manning和Bonner使用胰蛋白酶和膠原酶聯合來消化關節軟骨,把軟骨細胞從軟骨基質中分離出來,獲得了數量多、活性好的軟骨細胞,改變了軟骨細胞不能分裂的傳統觀點[12]。本研究采用兩步酶消化法配合機械吹打提取C57BL/6小鼠關節軟骨細胞,通過兩步酶消化法分離出大量高活力的小鼠關節軟骨細胞,配合適當的機械吹打,有助于Ⅱ型膠原酶與軟骨細胞的充分接觸,分離出更多數量的C57BL/6小鼠關節軟骨細胞。

軟骨細胞是在軟骨中發現的唯一一種細胞,具有生成和維持膠原和蛋白聚糖等軟骨基質的功能,主要包括Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖,是軟骨基質的主要成分,Ⅱ型膠原表達陽性是軟骨細胞的特征性標志[13]。本研究中對軟骨細胞的特征性標志Ⅱ型膠原及蛋白聚糖進行檢測,表明培養的細胞是軟骨細胞。正常的軟骨細胞隨著傳代次數的增加Ⅱ型膠原逐漸轉化成Ⅰ型膠原,且分泌蛋白聚糖的水平也會降低,從而出現去分化現象[14]。軟骨細胞甲苯胺藍著色深淺程度及Ⅱ型膠原mRNA的表達量與傳代次數呈正相關。根據趙明等[15]的形態學及免疫組織化學研究結果表示,體外培養3代以內的軟骨持表型的穩定,而3代后的軟骨細胞呈現出增殖緩慢及衰老的現象。因此,本研究主要考察3代內的軟骨細胞的形態變化,并利用3代內的軟骨細胞用于后續的實驗研究。

星形孢菌素是一種強效的ATP競爭性激酶抑制劑,能夠有效抑制蛋白激酶活性,抑制多種人癌細胞增殖,誘導細胞凋亡方法是激活胱天蛋白酶-3[16]。以往學者進行軟骨細胞的凋亡誘導時,使用的星形孢菌素濃度各不相同。Ahmed等[17]利用1 μmol/L星形孢菌素處理肥大軟骨細胞24 h誘導凋亡;Mukherjee等[18]發現軟骨細胞的活力依賴于星形孢菌素的濃度與作用時間,當隨著星形孢菌素濃度(0.1,1,10 μmol/L)和作用時間(2,4,8 h)的增加,軟骨細胞的活力逐漸降低。上述研究結果均以軟骨細胞作為研究對象,尚未對軟骨細胞的代數進行篩選。因此,基于實驗研究的需要,本實驗以3代內高活力表型良好的軟骨細胞為實驗基礎,設置了0-20 μmol/L的星形孢菌素濃度梯度,而由于不能確定實驗加藥組的凋亡程度,因此采用H2O2作為一個誘導較強凋亡的陽性對照組,結果發現在0-10 μmol/L的濃度范圍內,星形孢菌素對軟骨細胞的凋亡作用并不顯著,而超過10 μmol/L后,軟骨細胞的凋亡作用與H2O2陽性對照比無顯著差異。

本研究以3代內高活力表型良好的C57BL/6小鼠關節軟骨細胞為主要研究對象,流式結果證明星形孢菌素可以誘導軟骨細胞凋亡,同時利用AOEB法進一步驗證,10 μmol/L星形孢菌素作用于軟骨細胞24 h最適宜建立軟骨細胞的凋亡模型,為骨關節炎藥物的開發提供可參考的實驗方法。