不同亞型急性腦卒中患者外周血中T淋巴細胞亞群的分布

張海岳,關經緯,孔 琦,褚 敏,宋海慶,孟 然

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院神經內科,北京 100053;*通訊作者,E-mail:victor65@126.com)

腦卒中根據(jù)發(fā)病機制不同可分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中[1,2],其中約87%的腦卒中患者為缺血性腦卒中[3]。缺血性腦卒中發(fā)生后可迅速啟動一系列免疫應答和炎癥反應,是卒中后誘發(fā)腦組織損傷和修復的重要病理反應[4,5]。我們前期的動物實驗研究發(fā)現(xiàn),調節(jié)外周血中免疫細胞(主要包括T淋巴細胞亞群)的數(shù)量和功能,可有效改善腦缺血動物模型的卒中結局,達到腦保護的作用[6]。這些結果表明T淋巴細胞亞群在腦卒中發(fā)病和治療中發(fā)揮重要作用。

既往大量研究也發(fā)現(xiàn)T淋巴細胞及其亞群在缺血性腦卒中發(fā)病早期就被募集和激活,特別是CD4+輔助性T細胞和CD8+細胞毒性T細胞大量浸潤腦缺血區(qū)域,分別通過誘導白介素、細胞毒素和穿孔素等炎癥介質的產生,造成神經元細胞的壞死和損傷[7,8]。但是,目前有研究提出由于不同病因引起的腦缺血的部位、面積和程度不同,發(fā)生的免疫應答反應也有所差別[9]。其中T淋巴細胞亞群在不同類型缺血性腦卒中急性期的作用是否有差異還沒有統(tǒng)一定論。本研究旨在分析T淋巴細胞亞群在大動脈粥樣硬化性卒中患者和小動脈閉塞性卒中患者在急性期外周血中分布,探討不同病因缺血性腦卒中患者急性期免疫反應的差異。

1 材料和方法

1.1 患者臨床資料

連續(xù)納入2019年4月至2020年6月就診于首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院的急性缺血性腦卒中患者共40例。研究前經首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院倫理委員會的審查和批準(倫理號:[2018]117),并在研究中獲得了患者知情同意。納入患者臨床資料見表1。

表1 兩組納入患者的基本臨床資料Table 1 Patient characteristics in two groups

納入標準:①年齡18-80歲;②急性腦卒中發(fā)病到醫(yī)院就診時間≤7 d;③磁共振彌散序列成像(MRI-DWI)確認為新發(fā)缺血性腦卒中;④通過頸動脈血管超聲、經顱多普勒超聲(TCCD)、頭部及頸部CT血管成像、頭部MRA或數(shù)字減影血管造影(DSA)明確病因;⑤已超過靜脈溶栓時間窗并且已不能進行血管內治療的患者。

排除標準:①病因不明;②使用任何免疫抑制劑;③患有免疫性疾病;④嚴重心臟、肝臟及脾臟疾病。

分組依據(jù):根據(jù)TOAST分型診斷標準[10],將納入患者分為大動脈粥樣硬化性卒中和小動脈閉塞性卒中兩組。

1.2 流式細胞儀檢測T細胞亞群

所有納入患者在接受治療前通過肘部采集外周血,用于流式細胞儀檢測(BD LSRII,Becton Dickinson公司,美國)。所用抗體均購買于BD Pharmingen公司(美國)或BioLegend公司(美國)。流式細胞儀檢測方法:①采集患者靜脈血,充分抗凝。②每管取100 μl抗凝全血至流式管,按熒光抗體染色組合加入各自抗體。③將血液與熒光標記抗體混勻后室溫避光反應20 min。④每個樣品管加入1×紅細胞裂解液,混勻后室溫避光孵育10 min。⑤300g離心5 min,棄上清。⑥每個樣品管中加入流式細胞洗液,混勻后300g離心5 min,棄上清。⑦向每個樣品管中再次加入流式細胞洗液,混勻后4 ℃避光,及時用流式細胞儀檢測分析。⑧收集細胞,采用美國BD LSRII型流式細胞儀上機分析細胞群,用FACS Diva6.1.3軟件分析細胞群數(shù)據(jù)。檢測的細胞亞群包括:CD3+T細胞、CD3+CD4-CD8-T細胞(double-negative T cells,DNTs)、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用Shapiro-Wilk檢驗和Levene檢驗評估連續(xù)變量分布的正態(tài)性和方差齊性。如滿足正態(tài)分布,采用均值±標準差進行統(tǒng)計描述,并采用Student’st檢驗分析兩組變量之間的差異;如不符合正態(tài)分布,采用中位數(shù)(四分位數(shù)間距)進行統(tǒng)計描述,采用非參數(shù)檢驗進行組間比較。P<0.05表示有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 T淋巴細胞亞群在大動脈粥樣硬化性和小動脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比差異

研究結果表明CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞以及CD3+CD4-CD8-T細胞在大動脈粥樣硬化性卒中患者和小動脈閉塞性卒中患者外周血中百分比間的差異無統(tǒng)計學意義(均P>0.05,見圖1)。但是CD3+CD8+T細胞在小動脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比明顯高于大動脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比,兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.295,P=0.027,見圖1)。

SSC:側向角散射;FSC:前向角散射;CD:白細胞分化抗原圖1 不同亞型T細胞在缺血性腦卒中患者急性期外周血中的比例Figure 1 The proportion of different subtypes of T cells in peripheral blood of patients with acute ischemic stroke

2.2 性別及糖尿病對T淋巴細胞亞群在患者外周血中分布的影響

臨床資料分析顯示大動脈粥樣硬化組患者中女性發(fā)病比例和糖尿病發(fā)病比例高(見表1)。因此本研究進一步對比了男性患者組與女性患者組外周血中CD3+CD8+T細胞的百分比,結果顯示兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(t=0.908,P=0.370,見圖2)。為了排除糖尿病對研究結果的影響,課題組在研究中還對比了糖尿病組和無糖尿病組患者外周血中CD3+CD8+T細胞的百分比,結果顯示兩組間的差異無統(tǒng)計學意義(t=0.768,P=0.447,見圖2)。為了減少性別對CD3+CD8+T細胞在外周血中分布的影響,所有女性患者被去除后,對比兩組間男性患者外周血中CD3+CD8+T細胞的百分比差異,結果顯示小動脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比明顯高于大動脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比,兩組間差異具有統(tǒng)計學意義(t=2.214,P=0.035,見圖2)。

圖2 CD3+CD8+T細胞在不同人群缺血性腦卒中患者急性期外周血中的百分比Figure 2 Percentage of CD3+CD8+T cells in peripheral blood of patients with acute ischemic stroke in various populations

3 討論

缺血性腦卒中因其發(fā)病原因不同所致預后結局也有所差別,目前臨床推薦根據(jù)不同病因為患者提供確切的治療方式[11]。因此明確不同亞型腦卒中發(fā)病機制間的差異是目前臨床面對的一項主要問題。作為兩種最主要的腦卒中類型,大動脈粥樣硬化性卒中和小動脈閉塞性卒中成為目前病因學研究的重點。

顱內外血管的血栓形成是大動脈粥樣硬化性腦卒中發(fā)病的主要原因,可造成顱內外血管供血不足,從而導致腦細胞代謝功能障礙,并引起相應供血區(qū)腦組織發(fā)生炎癥反應,最終造成神經細胞的壞死和凋亡[12]。小動脈閉塞性卒中的發(fā)病多與長期高血壓對血管的損傷有關,長期高血壓引起小動脈壁玻璃樣變性、內膜增生硬化、動脈壁局部結構紊亂,逐步造成相應腦功能區(qū)供血障礙、細胞壞死、炎癥反應發(fā)生,并最終導致腦卒中的發(fā)生[13]。因此大動脈粥樣硬化性卒中和小血管閉塞性卒中在發(fā)病機制上具有一定的差異。

免疫反應在腦卒中急性期組織損傷及后期組織修復過程中發(fā)揮重要作用。大量動物實驗研究均表明,在缺血性腦卒中發(fā)病早期即出現(xiàn)明顯的免疫反應,在腦缺血區(qū)域可檢測到T淋巴細胞、單核細胞的過度募集,這些免疫細胞可通過刺激炎癥因子的產生和細胞毒性蛋白酶的分泌導致神經組織的損傷[14]。目前研究發(fā)現(xiàn)由于不同病因導致的腦卒中病理過程有一定的差異,因此不同病因的腦卒中患者的免疫反應也有差別[15]。

T淋巴細胞作為主要的免疫細胞,參與腦卒中急性期的組織損傷過程。既往科學研究發(fā)現(xiàn),在腦卒中患者急性期,40%侵入的T淋巴細胞為CD4+輔助性T細胞(CD3+CD4+T淋巴細胞),30%為CD8+細胞毒性T淋巴細胞(CD3+CD8+T淋巴細胞)[13]。CD4+T淋巴細胞通過介導白介素、腫瘤壞死因子等炎癥因子的產生誘發(fā)腦組織的損傷[7,16]。細胞毒性CD8+T淋巴細胞通過釋放細胞毒性蛋白酶參與神經元損傷的病理過程[17]。此外Meng Hailan課題組[18]研究發(fā)現(xiàn),CD3+CD4-CD8-T淋巴細胞通過調節(jié)小膠質細胞介導的炎癥反應參與了腦卒中發(fā)病過程中的腦組織損傷。

在本研究中,課題組應用流式細胞技術分析不同亞型缺血性腦卒中患者急性期外周血中T淋巴細胞的分布。結果表明CD3+T細胞、CD3+CD4+T細胞以及CD3+CD4-CD8-T細胞在大動脈粥樣硬化性卒中患者和小動脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比無明顯差異。但是CD3+CD8+T細胞在小動脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比明顯高于大動脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比,兩組間差異具有統(tǒng)計學意義。此結果提示,細胞毒性CD3+CD8+T淋巴細胞在小動脈閉塞性卒中患者急性期外周血中被更多活化。此外,有研究發(fā)現(xiàn)當腦組織損傷時,在外周血管腔內和周圍間隙有明顯的CD3+CD8+T細胞的聚集[19]。這一現(xiàn)象可能與CD3+CD8+T淋巴細胞在小動脈閉塞性腦卒中患者急性期外周血中表達增加有關。由于細胞毒性CD8+T淋巴細胞主要通過釋放細胞毒性蛋白酶參與神經組織的損傷,在未來研究中應該進一步檢測細胞毒性蛋白酶在小動脈閉塞性腦卒中發(fā)病過程中作用。

既往有研究提出隨著年齡增加,人群大動脈粥樣硬化負擔加重[20]。絕經后女性動脈粥樣硬化斑塊破裂風險增加,造成急性血管栓塞風險增高[21]。并且高齡患者發(fā)生糖尿病的風險增加[22]。在納入研究的患者中,臨床資料也顯示大動脈粥樣硬化組患者年齡較大,女性患者比例和糖尿病患者比例也較高。為了進一步驗證CD3+CD8+T細胞在小動脈閉塞性卒中患者和大動脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比差異,本研究分析了男性患者與女性患者外周血中CD3+CD8+T細胞的百分比,并且對比了糖尿病組和無糖尿病組患者外周血中CD3+CD8+T細胞的百分比,結果均提示組間無統(tǒng)計學差異。為了減少混雜因素影響CD3+CD8+T細胞在外周血中的表達,所有女性患者被去除后,再次對比了兩組男性患者外周血中CD3+CD8+T細胞的百分比差異,結果提示小動脈閉塞性卒中患者外周血中的百分比明顯高于大動脈粥樣硬化性卒中患者外周血中的百分比,兩組間差異具有統(tǒng)計學意義。這一結果提示CD3+CD8+T細胞在小動脈閉塞性卒中患者外周血中的分布增加在男性患者人群中更加明顯。

4 結論

與大動脈粥樣硬化性卒中患者相比,在小動脈閉塞性卒中患者急性期外周血中CD3+CD8+T淋巴細胞被更多活化,在缺血性腦卒中患者預后分析和治療中應考慮到不同病因誘發(fā)的免疫反應間的差異。但是本組研究樣本量偏小,并且為單中心病例研究,可能存在系統(tǒng)性誤差,在未來研究中,更多中心患者的數(shù)據(jù)應該被納入用于進一步的驗證。