湖北貝母活性成分與內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物研究

袁名遠(yuǎn)，李宇，譚旭輝，劉玉，方昕悅，冉亞蘭，何美軍

1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所/國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系恩施綜合試驗(yàn)站，恩施 445000；2.湖北民族大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，恩施 445000； 3.恩施土家族苗族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，恩施 445000

湖北貝母(FritillariahupehensisHsiao et K. C. Hsia)屬百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria)，野產(chǎn)于湖北恩施地區(qū)，民間稱之為“板貝”“窯貝”，常作為川貝使用，藥用歷史悠久[1]。湖北貝母具有清熱潤(rùn)肺、化痰止咳的功效，常用于治療熱痰咳嗽、痰核瘰疬、癰腫瘡毒等癥狀[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，湖北貝母具有抑菌[3]、降壓[4]、鎮(zhèn)咳平喘[5]等功效。貝母素乙是貝母中的重要生物堿成分之一，是《中國(guó)藥典》中規(guī)定的貝母品質(zhì)定量檢測(cè)指標(biāo)，在抑制結(jié)腸癌[6]、緩解心肌炎[7]、減輕肺損傷[8]等方面有顯著作用。植物內(nèi)生菌主要包括內(nèi)生細(xì)菌、內(nèi)生真菌和內(nèi)生放線菌三類微生物，在長(zhǎng)期的進(jìn)化中與宿主植物“協(xié)同進(jìn)化”，形成互利共生關(guān)系[9]。已有研究發(fā)現(xiàn)藥用植物中多種重要藥用成分紫杉醇、長(zhǎng)春花堿、龍血褐、異大戟素和巨大戟醇等均受到植物內(nèi)生菌誘導(dǎo)合成或積累調(diào)控[10]。此外，內(nèi)生菌能產(chǎn)生具有生物活性的代謝產(chǎn)物，如抗氧化類[11]、抗菌類[12]、抗腫瘤類[13]、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)類[14]等物質(zhì)，在醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)方面具有重要意義。

貝母常以鱗莖入藥，在其枯萎期采摘，此時(shí)貝母地上部分包括花、葉均已枯萎凋落[15]，利用率不高，造成了貝母資源的浪費(fèi)。截至目前，關(guān)于湖北貝母內(nèi)生菌、次級(jí)代謝產(chǎn)物及其抑菌活性的相關(guān)研究尚無文獻(xiàn)報(bào)道。本文通過研究湖北貝母不同組織中活性成分含量、內(nèi)生菌組成及其次級(jí)代謝產(chǎn)物活性，以期為湖北貝母資源的合理開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

選擇30株1年生、長(zhǎng)勢(shì)一致的湖北貝母健康植株，株高30～40 cm，鱗莖直徑2.0～3.0 cm，通過五點(diǎn)采樣法于2021年4月15日上午10：00在湖北省恩施市三岔鎮(zhèn)采集，由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所鑒定。標(biāo)準(zhǔn)品貝母素乙和抗生素氨芐青霉素，從阿拉丁試劑有限公司購(gòu)買；二甲基亞砜、EDTA、苯酚、三氯甲烷、無水乙醇等，從天津科密歐化學(xué)試劑有限公司購(gòu)買。

10株供試細(xì)菌(表1)由中國(guó)科學(xué)院熱帶海洋生物資源與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定和提供。

表1 供試革蘭陽性菌和革蘭陰性菌類型 Table 1 Tested gram-positive and gram-negative bacteria

DFY-1000中草藥磨粉機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，TS-200B恒溫?fù)u床(上海精其儀器有限公司)，BSD-400震蕩培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，RE-200A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛朗儀器有限公司)，DZF-6020真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，HP4500酶標(biāo)儀(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)等。

1.2 不同組織中貝母素乙含量檢測(cè)方法

供試樣品制備：湖北貝母洗凈除雜，鱗莖、花、葉分別裝盤置于40 ℃恒溫干燥箱干燥，粉碎后過篩(篩孔直徑0.27 mm)，按料液質(zhì)量體積比1∶50 (g/mL)加入乙酸乙酯，超聲功率500 W下超聲30 min，經(jīng)減壓濃縮、真空干燥得不同組織提取物浸膏。分別取適量浸膏用乙酸乙酯充分溶解，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液進(jìn)樣分析，以分析純乙酸乙酯進(jìn)樣作為對(duì)照組。

色譜條件：Agilent 19091S-433毛細(xì)管柱(HP-5MS 5% Phenyl Methyl Silox，30 m×250 μm)。升溫程序：初始溫度100 ℃，保持3 min；3～15 min，從100 ℃升至280 ℃；15～20 min，溫度保持280 ℃不變；20～35 min，從280 ℃升至310 ℃；35～40 min，溫度保持310 ℃不變。進(jìn)樣口溫度為310 ℃，載氣為高純度氦氣(99.999%)，流速為1.8 mL/min，進(jìn)樣量為5 μL，不分流。

采用氣相色譜(GC)外標(biāo)法[16]檢測(cè)湖北貝母鱗莖、花、葉中貝母素乙的含量，設(shè)定貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為1.13、2.25、4.50、6.75、9.00、11.25 mg/mL。分別進(jìn)行精密度和重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，每個(gè)樣品重復(fù)6次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，公式如下：

式中，C為不同組織中貝母素乙的含量，mg/g；n為氣相色譜檢測(cè)的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為不同組織供試液體積，mL；m為不同組織供試樣品質(zhì)量，g。

1.3 內(nèi)生菌的分離鑒定

湖北貝母全株表面洗凈，4%次氯酸鈉溶液消毒、75%乙醇浸泡5 min；無菌水沖洗5～7次，培養(yǎng)觀察，確認(rèn)徹底消毒。無菌條件下將貝母全株于2 mL無菌水中輕柔研磨成懸浮液，稀釋涂布培養(yǎng)，(28±2) ℃培養(yǎng)7 d，采用劃線法純化獲得單克隆[17]。將純化的內(nèi)生菌單克隆接入LB培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min培養(yǎng)24～48 h，提取內(nèi)生菌基因組DNA為模板，27F、1492R引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA序列，ITS1、ITS4引物擴(kuò)增真菌ITS序列，擴(kuò)增產(chǎn)物送武漢奧科鼎盛公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLSAT分析，獲得與菌株同源的16S rDNA、ITS序列，采用 MEGA-X 7.0[18]軟件中的鄰接法構(gòu)建內(nèi)生真菌和細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物抑菌活性測(cè)定

運(yùn)用瓊脂擴(kuò)散法[19]測(cè)試4種內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的抑菌活性，配制4種次級(jí)代謝產(chǎn)物測(cè)試液(100 mg/mL)； 設(shè)置陽性對(duì)照組(氨芐青霉素)和陰性對(duì)照組(DMSO溶液)，測(cè)量抑菌圈直徑，直徑≥20 mm的判斷為高敏，10～20 mm為中敏，≤10 mm為輕敏或耐藥。運(yùn)用微量二倍稀釋法[20]測(cè)定4種內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)供試菌的最小抑菌質(zhì)量濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(minimal bactericidal concentration，MBC)，設(shè)陽性對(duì)照組(加入100 μg/mL氨芐青霉素)，每組重復(fù)3次，計(jì)算MIC和MBC值[21]。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同組織中的貝母素乙含量

通過外標(biāo)法檢測(cè)到貝母素乙檢出限、定量限分別為15.77、57.27 μg/mL。得到線性回歸方程Y=900.30X-49.25 (R2=0.999 6)，表明貝母素乙在1.13～11.25 mg/mL線性關(guān)系良好，適合用于分析測(cè)定。分別向一定量鱗莖、花、葉供試液中準(zhǔn)確添加適量貝母素乙標(biāo)準(zhǔn)品使其質(zhì)量濃度分別達(dá)到1.79、0.78、3.20 mg/mL，采用相同色譜條件進(jìn)行定量檢測(cè)，計(jì)算得出其加樣回收率分別為97.6%、97.4%、98.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD分別為1.18%、1.78%、2.70%，表明氣相色譜法回收率較好，準(zhǔn)確度較高。

如表2所示，氣相色譜法檢測(cè)到湖北貝母鱗莖、花、葉中貝母素乙含量分別為2.24±0.17、0.94±0.13、3.99±0.10 mg/g，說明不同組織中貝母素乙含量具有顯著性差異，葉中含量最高，鱗莖次之，花中含量最低，其中貝母葉的含量為鱗莖的1.78倍，為花的4.24倍。

表2 湖北貝母不同組織中貝母素乙含量 Table 2 Content of peiminine B of different tissue of F. hupehensis

2.2 內(nèi)生菌鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

對(duì)從湖北貝母全株中分離的1株內(nèi)生細(xì)菌(BM-X-6)和3株內(nèi)生真菌(BM-Z-1、BM-Z-3、BM-Z-5)樣品的16S rDNA和ITS序列進(jìn)行擴(kuò)增、測(cè)序，獲得其序列信息，其堿基對(duì)全長(zhǎng)分別為1 447、596、590、618 bp。利用Blast軟件與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行同源比對(duì)，選取相似性≥98%的菌種，應(yīng)用MEGA-X 7.0軟件，選擇鄰接法，利用極大似然估計(jì)法構(gòu)建內(nèi)生菌系統(tǒng)發(fā)育樹(進(jìn)行1 000次自展檢測(cè)，Bootstrap值≥80%)基因組的遺傳變異度為0.5(圖1、圖2)。

圖1 基于 16S rDNA 序列構(gòu)建的湖北貝母內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 16S rDNA phylogenetic tree of endophytic bacteria of F. hupehensis

圖2 基于 ITS 序列構(gòu)建的湖北貝母內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 ITS phylogenetic tree of endophytic fungi of F. hupehensis.

將BM-X-6內(nèi)生細(xì)菌擴(kuò)增序列提交到GenBank，獲得登錄號(hào)為MZ477239。由圖1湖北貝母內(nèi)生細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹可見，BM-X-6與假單胞菌屬(Pseudomonas)的親緣關(guān)系最近，其中BM-X-6與Pseudomonassp. (MG266378.1)序列相似性最高，為99.03%，與Pseudomonashelmanticensis(MK070159.1)和Pseudomonasfluorescens(MK774791.1)等序列相似性也分別達(dá)到98.38%和98.95%；據(jù)此可以初步將BM-X-6鑒定為假單胞菌屬菌株，并命名為Pseudomonassp. BM-X-6。

將BM-Z-1、BM-Z-3、BM-Z-5這3種內(nèi)生真菌擴(kuò)增序列提交到GenBank，獲得登錄號(hào)分別為：MZ477229、MZ477231、MZ477232。由圖2系統(tǒng)發(fā)育樹可見，3株內(nèi)生菌與曲霉菌屬(Aspergillus)或節(jié)菱孢霉菌屬(Arthrinium)存在進(jìn)化關(guān)系。通過比對(duì)，BM-Z-5與Arthriniumrasikravindrae(KP269008.1)序列相似性最高，為98.05%; BM-Z-1與Aspergillusversicolor(KX776009.1)等多個(gè)序列相似性較高，且與Aspergillustabacinus(MH911388.1)聚為一簇；BM-Z-3與Aspergillussp. BX (KJ567464.1)等多個(gè)序列相似性較高，且與Aspergilluscarneus(KM458808.1)聚為一簇，此外BM-Z-1、BM-Z-3還屬于同一個(gè)分支。綜上，可以將BM-Z-5初步鑒定為節(jié)菱孢霉菌屬菌株，將其命名為Arthriniumsp. BM-Z-5；將BM-Z-1、BM-Z-3初步鑒定為曲霉菌屬菌株，并分別命名為Aspergillussp. BM-Z-1、Aspergillussp. BM-Z-3。

2.3 內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌活性分析

如表3所示，瓊脂擴(kuò)散法結(jié)果表明，4種內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)10株供試菌有不同的抑菌活性，抑菌圈直徑越大說明抑菌效果越強(qiáng)。Aspergillussp. BM-Z-1、Aspergillussp. BM-Z-3、Arthriniumsp. BM-Z-5及Pseudomonassp. BM-X-6這4種次級(jí)代謝產(chǎn)物分別對(duì)2、3、9、1株供試菌具有中度抑制作用(抑菌圈直徑≥10 mm)。其中Arthriniumsp. BM-Z-5次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)除枯草芽孢桿菌外的其余9株供試菌均有中度抑制作用，且相較其余3種次級(jí)代謝產(chǎn)物，只有Arthriniumsp. BM-Z-5次級(jí)代謝產(chǎn)物能對(duì)肺炎克雷伯菌(10.90±0.56 mm)、金黃色葡萄球菌(11.56±0.36 mm)、藤黃微球菌(10.07±0.49 mm)、鮑曼不動(dòng)桿菌(11.94±0.21 mm)以及具有耐抗生素的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(10.67±0.24 mm)等5種供試菌起中度抑制作用，呈廣譜抑菌特性，而Aspergillussp. BM-Z-1與Pseudomonassp. BM-X-6次級(jí)代謝產(chǎn)物只對(duì)2種供試菌有抑制作用，抑菌譜最窄；此外，所有的內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物都對(duì)蘇云金芽孢桿菌有良好的抑制作用。

表3 湖北貝母內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的抑菌圈直徑 Table 3 Inhibition zone diameter of secondary metabolites of endophytic of F. hupehensis mm

采用微量二倍稀釋法進(jìn)一步測(cè)定有明顯中度抑菌作用的處理組的最小抑菌質(zhì)量濃度(MIC)和最小殺菌質(zhì)量濃度(MBC)值，結(jié)果如表4所示。由表4可知，相較其余3種次級(jí)代謝產(chǎn)物，Aspergillussp. BM-Z-1次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)蘇云金芽孢桿菌有最強(qiáng)的抑制效果，其MIC值為0.36 mg/mL，MBC值為5.83 mg/mL。Aspergillussp. BM-Z-3次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)枯草芽孢桿菌、表皮葡萄球菌的抑制效果較好，其MIC值為0.50～1.00 mg/mL，MBC值為8.04～16.08 mg/mL。Arthriniumsp. BM-Z-5次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、藤黃微球菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有中度抑制活性，其MIC值均為1.59 mg/mL，MBC值為12.76～25.52 mg/mL。

表4 湖北貝母內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的最小抑菌質(zhì)量濃度和最小殺菌質(zhì)量濃度 Table 4 MIC and MBC of secondary metabolites of endophytic of F.hupehensis mg/mL

3 討 論

湖北貝母作為恩施地區(qū)道地藥材，使用歷史悠久，但其藥用部位僅采用鱗莖，而花、葉等非藥用部位在采收時(shí)被丟棄[22-24]。筆者研究發(fā)現(xiàn)，湖北貝母不同組織中貝母素乙的含量差異巨大，葉中貝母素乙的含量遠(yuǎn)高于鱗莖和花。這說明葉、花等地上部分均具有高含量的生物堿活性成分，具有藥用前景和潛在的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可為湖北貝母資源的綜合開發(fā)利用提供新的思路。

內(nèi)生菌長(zhǎng)期生活在宿主植物體內(nèi)，是植物微生態(tài)系統(tǒng)不可缺少的部分之一。植物內(nèi)生菌在與植物長(zhǎng)期協(xié)同進(jìn)化過程中形成了豐富的微生物資源，不同植物體、甚至同一植物體不同器官中內(nèi)生菌的多樣性和組成都不盡相同[25]。

筆者從湖北貝母中分離出1株假單胞菌Pseudomonassp. BM-X-6，1株節(jié)菱孢霉菌Arthriniumsp. BM-Z-5，2株曲霉菌Aspergillussp. BM-Z-1、Aspergillussp. BM-Z-3。同時(shí)，這3個(gè)內(nèi)生菌屬也在浙貝母[26]、甘蔗[27]、夾竹桃[28]等植物體中被發(fā)現(xiàn)。

藥用植物與其體內(nèi)的內(nèi)生菌之間存在復(fù)雜的微生態(tài)關(guān)系，誘導(dǎo)、脅迫藥用植物或者自身能產(chǎn)生抑菌、抗病毒、殺蟲、抗氧化、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)等物質(zhì)，提高宿主植物抗逆、抗脅迫和抗病害的能力[29-30]。本研究抑菌結(jié)果表明，湖北貝母中分離出的不同內(nèi)生真菌和內(nèi)生細(xì)菌次級(jí)代謝產(chǎn)物均有抑菌活性，但是有較大差異。其中Arthriniumsp. BM-Z-5次級(jí)代謝產(chǎn)物抑菌譜最廣，且對(duì)革蘭陽性細(xì)菌如金黃色葡萄糖球菌、糞鏈球菌、蘇云金芽孢桿菌、耐甲氧西林表皮葡萄球菌和鮑曼不動(dòng)桿菌共5株供試菌有良好的抑制效果。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)：從白芨中分離鑒定的1株假單胞菌對(duì)藤黃微球菌、金黃色葡萄球菌以及大腸桿菌等有抑菌活性[31]；從紫玉盤中分離鑒定的1株節(jié)菱孢霉菌對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有一定的抑制效果[32]；從滸苔中分離鑒定的1株曲霉菌對(duì)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌等具有較強(qiáng)的抑制能力[33]。筆者所在課題組前期研究中分離的4株內(nèi)生菌與這些文獻(xiàn)所報(bào)道的內(nèi)生菌雖在同一屬，但是抑菌活性的差異較大，推測(cè)是其次級(jí)代謝產(chǎn)物成分不同所致[34]。

后續(xù)將進(jìn)一步構(gòu)建湖北貝母無菌愈傷組織、無菌組培苗，再通過共培養(yǎng)4株內(nèi)生菌的方式研究?jī)?nèi)生菌對(duì)湖北貝母中貝母素乙等生物堿類化合物生物合成與積累的影響規(guī)律,并對(duì)這些內(nèi)生菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的抑菌活性成分進(jìn)行分離鑒定，以期為開發(fā)新型抗菌藥物、緩解菌株耐藥性提供參考依據(jù)。