碳氮磷營養對百蕊草懸浮培養細胞生長的影響

黃燕芬 ，王自布，施 琴 ，謝 奇

(1.貴州師范學院生物科學學院，貴州 貴陽 550018；2.貴州省生物資源開發利用特色重點實驗室，貴州 貴陽 550018)

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為用野生百蕊草葉為外植體誘導的生長旺盛、質地松散的淡黃色愈傷組織。

1.2 方法

1.2.1 懸浮培養細胞系的建立及培養基質中碳、氮、磷消耗量檢測 取供試愈傷組織，切成小塊或夾碎接種于液體培養基BRCIII (MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.15 mg/L+2，4-D 0.3 mg/L+30 g/L蔗糖，pH 5.7～5.9)中培養。培養溫度(24±1)℃，培養箱轉速115 r/min，每個錐形瓶(容量100 mL)內裝40 mL培養液，每瓶接種量約2 g，于黑暗處培養2～3 d后轉移至弱光處培養。在懸浮培養初期(3～5 d)用0.425 mm的無菌過濾篩對培養物過濾1次，除去大細胞團和組織塊，保留分散程度好的小細胞團及單細胞。每3 d 顯微觀察1次，并棄去上液，按1/3體積比(原液/新鮮培養液)轉入新鮮培養液。觀察見細胞團較小，分散度、均一性較好，懸浮細胞呈淺黃色，生長狀態穩定，生物量迅速增加時即可作為種子細胞液。取1份種子細胞液、3份新鮮培養液進行懸浮培養，每間隔2 d 取1次懸浮細胞培養液(連續取樣30 d)，測定細胞生長量，繪制懸浮細胞生長曲線，同時測定培養基質中碳、氮、磷消耗量。

1.2.2 篩選培養基質最適氮、磷源濃度 將培養基BRCIII中總氮設置7種起始濃度，即50、55、60、65、70、75和80 mmol/L，磷酸鹽設置5種起始濃度，即1.20、1.25、1.30、1.35和1.40 mmol/L，均為3次重復。按照1.2.1方式接種種子細胞液于不同氮、磷起始濃度培養基中培養至第28天時，分別測定細胞干物質量，篩選最適氮、磷起始濃度。

1.2.4 細胞生長情況檢測 用布氏漏斗抽濾懸浮培養系除去培養液，再以蒸餾水沖洗、抽濾3次，盡量抽去胞間隙水分，最后將細胞于50 ℃烘干至恒重[15]，按照下列公式計算細胞干物質量和細胞生長速率。

細胞干物質量(g/L)=收獲細胞的干物質量(g)-接種細胞的干物質量(g)

細胞生長速率[g/(L·d)]=細胞干物質量(g/L)/培養天數(d)

1.2.5 培養基質碳、氮、磷營養的測定方法 以培養液離心得到的上清液為待測液，分別采用苯酚硫酸法(略改動)測定總糖含量[16]、蒽酮比色法測定蔗糖含量[17]、3，5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖含量、水楊酸—濃硫酸法測定硝態氮含量、苯酚—次氯酸鹽法測定銨態氮含量[18]；鉬藍比色法(略改動)測定磷酸根含量[19]。

1.2.6 數據統計與分析 采用Excel 2010整理原始數據，SPSS 17.0進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 懸浮培養細胞生長規律

從圖1看出，在30 d的培養過程中，懸浮細胞生長曲線出現較明顯的延滯期(0～6 d )、對數生長期(7～15 d )、穩定生長期(16～24 d )和衰亡期(24 d 后)，生長速率的變化情況與之相符。延滯期細胞剛轉入鹽濃度和滲透壓均較高的培養液中，處于適應階段，前3 d生長比較緩慢，干物質量變化不大，后3 d開始上升；培養7～15 d 時細胞經過延滯期物質和能量的準備，分裂活躍，生長迅速，在15 d時干物質量達第1個峰值，生長速率達最高峰，呈現良好的生長狀態；培養16～24 d 時，細胞干物質量繼續增加，上升相對趨于平穩，至24 d時達第2個生長高峰，而生長速率則是先迅速下降之后有少許上升；細胞培養24 d后干物質量緩慢下降，到30 d時下降到9.70 g/L，生長速率則從0.12 g/(L·d)急速下降到0.07 g/(L·d)。原因可能是隨著培養時間延長，瓶內營養條件和環境不利于繼續培養，細胞開始衰亡。因此，細胞懸浮培養適宜的繼代周期確定為15～24 d，最長培養時間不宜超過30 d。

2.2 培養液中碳、氮、磷營養的消耗量

2.2.1 碳營養 百蕊草細胞懸浮培養液中碳源為蔗糖，當蔗糖逐漸水解為還原糖后，總糖含量不變，蔗糖的濃度快速降低，還原糖的含量迅速增加。從圖2看出，在培養0～9 d期間因細胞長勢緩慢總糖的消耗速度較慢；對數生長期至穩定生長期因細胞持續生長，總糖消耗量大，消耗速度比較均衡；衰亡期后總糖消耗緩慢，到培養30 d時只剩0.45 mg/mL。蔗糖含量在延遲期因大量水解快速降低，從24.3 mg/mL降至3.55 mg/mL；進入對數生長期后含量已較低變化較小，對數生長期結束時(24 d)含量僅0.17 mg/mL。還原糖在延滯期由起始培養時的3.14 mg/mL快速上升到22.65 mg/mL，原因是蔗糖水解為能被植物細胞吸收的還原糖(葡萄糖和果糖)，但細胞還未進入快速生長階段，消耗量較少；從進入對數生長期開始，還原糖作為直接碳源，變化趨勢與總糖大體一致，隨著細胞的快速生長，被大量消耗，呈現持續快速下降趨勢，由21.80 mg/mL下降至1.65 mg/mL。到衰亡期消耗開始減慢，變化幅度明顯變小。

圖1 懸浮細胞不同培養時間百蕊草的細胞干物質量和生長速率Fig.1 The dry matter mass and growth rate of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different culturing time

2.2.2 氮營養 從圖3看出，在延滯期硝態氮消耗量較低，僅11.43%，銨態氮被迅速利用，消耗83.87%。進入對數生長期硝態氮含量快速下降，到培養15 d時只剩24.07%，銨態氮剩6.38%，此時細胞處于第1個生長高峰，基質中的大部分氮源被消耗。第2個生長高峰(24 d)細胞生長仍以吸收硝態氮的為主，銨態氮低幅下降。培養30 d時，硝態氮含量為2.06 mmol/L，銨態氮0.61 mmol/L。可見，氮對于懸浮培養細胞的生長影響較大，銨態氮的吸收利用優先于硝態氮，但是需求量則是硝態氮大于銨態氮。

2.2.3 磷營養 磷是植物細胞中核酸、核蛋白、磷脂、磷酸腺苷和多種酶等的組成成分，在植物細胞代謝中起著重要作用。從圖4看出，培養液磷酸鹽的含量與懸浮培養細胞生長密切相關。培養期間磷酸根離子被大量吸收，在延滯期內消耗達33.87%；進入對數生長期細胞生長旺盛，磷酸根離子的消耗量顯著增大，至穩定生長初期培養液中磷酸根離子含量僅為15.20%；隨著培養時間的增加，因細胞生長速率的下降磷酸根離子消耗幅度變小，培養30 d時磷酸根離子為4.24%，幾乎耗盡。

圖2 百蕊草懸浮培養細胞碳的消耗量Fig.2 The carbon consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

圖3 百蕊草懸浮培養細胞氮的消耗量Fig.3 The nitrogen consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

2.3 培養液中氮、磷源起始濃度對懸浮細胞生長的影響

2.3.1 氮源 氮源是懸浮培養細胞生長的重要營養物質，適宜的氮濃度對于懸浮細胞生長有促進作用。從圖5看出，在培養28 d時百蕊草懸浮細胞干物質量隨著氮濃度的增加不斷上升，當氮濃度達70 mmol/L時，干物質量達最大值9.71 g/L。隨著氮濃度的繼續增加，干物質量開始下降，說明細胞生長開始受到抑制。原因可能是隨著氮濃度的增大，細胞內銨態氮的濃度相應增高，對細胞產生毒害作用而抑制細胞的生長。

2.3.2 磷源 從圖6看出，不同磷酸鹽初始濃度對百蕊草細胞增殖生長有著不同的影響。細胞懸浮培養28 d時，隨著磷酸鹽濃度從1.15 mmol/L增大到1.30 mmol/L，細胞干物質量表現出逐漸增加并達峰值；此后隨著磷酸鹽濃度升高，細胞干物質量逐漸減少，表明百蕊草細胞懸浮培養以1.30 mmol/L的磷酸鹽濃度較適合。說明磷在百蕊草細胞生長代謝中起著重要作用，適宜濃度的磷促進細胞生長，過高或過低都不利于細胞的生長。

圖4 百蕊草懸浮培養細胞磷酸鹽的消耗量Fig.4 The phosphate consumption of Thesium chinese Turcz.suspension cells

圖6 百蕊草懸浮培養液中不同磷濃度下細胞的干物質質量Fig.6 The dry matter mass of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different phosphorus

圖7 百蕊草懸浮培養液中不同下細胞的干物質質量Fig.7 The dry matter mass of Thesium chinese Turcz.suspension cells with different concentration

3 討 論

研究結果顯示，培養周期內細胞對基質中碳、氮、磷營養的消耗動態變化與細胞各個增殖生長階段的營養需求大體吻合。培養0～6 d，細胞適應新的生長環境，加之吸收的營養物質主要儲存在細胞內為快速生長作準備，因此生長緩慢，但對營養物質吸收迅速，使得培養液營養物質消耗較大; 培養7～15 d， 細胞因大幅吸收培養液中營養物質和前期營養物質的儲存充足，生長迅速，干物質量達第1個高峰，此時培養液營養物質濃度快速下降；15～24 d ，細胞干物質量緩慢上升，于24 d 達最大值，原因是在培養液營養物質濃度較低的情況下，細胞生長主要靠少量吸收培養液營養和消耗自身存儲，生長速率短暫下降后逐漸恢復穩定上升; 培養24 d 之后，細胞中儲存的營養物質和培養液中的營養物質不足，細胞生長進入衰亡期，生長速率迅速下降。可見培養液中碳源、氮源(硝態氮和銨態氮)、磷源的含量與細胞增長關系密切。因此，建立懸浮細胞培養體系時，為保證細胞能健康快速生長，摸清懸浮培養過程中細胞生長規律及其對基本營養物質的需求情況，確定其初始投入量至關重要。

氮是構成植物蛋白質、核酸、磷脂及其它生長發育所必需的有機氮化合物的重要成分，也是植物細胞生長、發育及次生代謝物產生必不可少的營養物質，對懸浮細胞生長具有重要影響。百蕊草細胞懸浮培養液中的氮源包括硝態氮和銨態氮，二者濃度的動態變化并不同步，此情況與南方紅豆杉細胞懸浮培養的結果相近[20]。磷是植物體內的核酸、核蛋白、磷脂、植素、磷酸腺苷和多種酶的組成成分。核酸和核蛋白是細胞核與原生質的組成成分，在植物生命活動與遺傳變異中具有重要功能。試驗結果表明：不同起始濃度的氮和磷在懸浮細胞培養28 d時，在起始總氮濃度70 mmol/L及磷酸鹽濃度1.3 mmol/L時，懸浮細胞培養的干物質量均達最大值，低于或者高于此兩濃度均不利于細胞的健康生長。在此基礎上進一步研究懸浮培養細胞對硝態氮、銨態氮的需求結果發現，培養過程中懸浮細胞生長對硝態氮的消耗多于銨態氮，銨態氮的濃度過高會抑制細胞生長。銨態氮和硝態氮的比例為20/50 最適于細胞生長。銨態氮的利用消耗先于硝態氮。

4 結 論