云南西雙版納地區橡膠樹炭疽病菌的系統進化分析和室內藥劑篩選

2021-02-12 11:36:54徐從英梁曉宇

西南農業學報 2021年12期

徐從英，王萌，梁曉宇，馬騰，楊葉，張宇*

(1.海南大學化學工程與技術學院，海南海口 570228；2.海南大學植物保護學院，海南海口 570228； 3.天然橡膠省部共建協同創新中心，海南海口 570228)

【研究意義】橡膠樹(Heveabrasiliensis)因相較于其他產膠植物具有不可媲美的優越性，在亞非拉國家適宜地區廣泛種植。我國橡膠樹的種植主要分布在云南、海南、廣東、廣西等熱帶、亞熱帶地區[1]。其中云南因其光照充足、少寒害低溫、晝夜溫差大、無臺風襲擊等獨特自然地理條件，已成為我國最好的天然橡膠基地[2]。2011年底，云南省橡膠種植面積首超海南省成為我國橡膠種植面積最大的省份，其中主要植膠區西雙版納的橡膠樹干膠產量占云南省干膠總產量的72.73%[3]。由炭疽菌(Colletotrichumspp.)引起的炭疽病是橡膠樹的重要葉部病害之一。該病菌可侵染橡膠樹的葉、嫩梢和果實，嚴重時引起嫩葉脫落、嫩梢回枯、果實腐爛[4]。由于氣候變化、病原菌適應環境性增強、橡膠樹抗病性下降等因素，該病發生日趨頻繁，嚴重影響膠乳產量[5-6]。而該病原菌的分類鑒定對橡膠樹炭疽病防治具有重要意義。【前人研究進展】炭疽菌種類繁多，遺傳多態性豐富，目前我國橡膠樹炭疽病主要病原菌為膠孢炭疽菌復合群 (Colletotrichumgloeosporioidesspecies complex) 和尖孢炭疽菌復合群(Colletotrichumacutatumspecies complex)。其中膠孢炭疽復合群包括C.siamense、C.fructicola、C.ledongense等，尖孢炭疽復合群包括C.bannanense、C.australisinense、C.laticiphilum、C.wanningense等[7-8]。由于復合群中的不同種的生物學特性不同，使得橡膠樹膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌復合群內在種群比例、分布范圍、為害癥狀和為害程度等方面存在明顯差異[9]。【本研究切入點】目前膠孢炭疽復合群下的C.siamense以及尖孢炭疽復合群下的C.wanningense為海南地區橡膠樹炭疽菌的優勢種[10]，云南地區橡膠樹炭疽菌復合群的種屬分類及優勢種尚不明確。【擬解決的關鍵問題】本研究通過對云南西雙版納地區橡膠樹炭疽病菌的系統進化分析和室內藥劑篩選，明確云南主要植膠區的橡膠樹炭疽菌復合群的種屬分類及優勢種，為橡膠樹炭疽病病原檢測和制定有效防治策略提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試藥劑、培養基、菌株：98%咪鮮胺(Prochloraz)、96%苯醚甲環唑(Difenoconazole)、98%嘧菌酯(Azoxystrobin)、97.5%吡唑醚菌酯(Pyraclostrobin)原藥購自海南正業中農高科股份有限公司，吡噻菌胺(Penthiopyrad)分析標準品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 (PDA)：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，蒸餾水定容至1000 mL。本實驗室提供的HN16菌株為在我國首次發現的橡膠樹炭疽病菌C.cliviae菌株[11]。

供試試劑及儀器：DNA 提取試劑盒購自Omega公司，高保真PCR 擴增試劑盒及DNA Marker購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。BDS400倒置生物顯微鏡購自重慶奧體光學儀器有限公司，T100-PC PCR擴增儀購自美國伯樂公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌的采集和分離橡膠樹炭疽病病葉于2019年2月22—23日期間采集于云南省西雙版納地區景洪市東風農場(21.72°N,100.78°E)和勐臘縣勐捧農場(21.41°N,101.38°E)。每個采集地選取20個發病植株，每株采集一個具有典型發病癥狀的葉片。在病健交界處切取5.0 mm ×5.0 mm大小的葉片，用75%酒精浸泡40～60 s，再用0.1%的升汞浸泡1～2 min后用無菌水漂洗3次，放在滅菌濾紙上晾干后置于PDA平板上。于28 ℃恒溫培養箱中培養3～4 d，選取菌落邊緣的菌絲繼續純化培養。

1.2.2 形態學鑒定將純化后的菌株接種在PDA平板上，28 ℃條件下培養5 d，觀察菌落形態并測量直徑，在顯微鏡下觀察10個以上視野的分生孢子形態特征，每個視野觀察20個孢子，根據炭疽菌分生孢子形態特征初步鑒定后[12]，單孢分離所得的菌株編號并于4 ℃冰箱中保存備用。

1.2.3 病原菌致病性測定挑選健康的橡膠樹變色期葉片用75%酒精表面消毒處理1 min，再用無菌水清洗3次，晾干備用。選取已產生橘色孢子堆的炭疽菌PDA平板，用無菌水洗下分生孢子，制成濃度為106個/mL的孢子懸浮液。取10 mL孢子懸浮液對葉片正面進行噴施接種。對照采用無菌水處理，設5個重復。將接種的橡膠樹葉放置在帶有濕潤無菌濾紙的塑料盒中，在28 ℃、100%相對濕度的人工氣候箱中培養直至發病癥狀出現，觀察統計葉片發病情況。分離純化發病葉片中的病原菌，與原接種菌株比較形態特征。

1.2.4 病原菌的分子生物學鑒定通過DNA提取試劑盒提取橡膠樹炭疽菌的基因組DNA。靶標基因為核糖體轉錄間隔(ITS)、肌動蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(TUB)、3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)、幾丁質合成酶基因(CHS-1)，引物序列與反應體系同文獻[13]。擴增產物送廣州天一輝遠基因科技有限公司測序。測序所得序列分別與GenBank數據庫中已知基因序列進行BLAST同源性檢索，從GenBank數據庫中下載與待測菌株相似度95%以上的部分炭疽菌菌株序列，采用鄰接法運用MEGA 7.0軟件構建系統發育樹。

1.2.5 5種殺菌劑對橡膠樹C.cliviae菌株的室內毒力測定采用菌絲生長速率法測定供試橡膠樹C.cliviae菌株對咪鮮胺、苯醚甲環唑、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、吡噻菌胺的敏感性[12]。根據預備試驗設計不同藥劑系列濃度：0.01、0.05、0.1、0.5、1 mg/L(咪鮮胺)；0.1、0.5、1、2、5 mg/L(苯醚甲環唑)；0.1、0.5、1、5、10 mg/L(嘧菌酯 + 50 mg/L 水楊羥肟酸)；0.1、0.5、1、5、10 mg/L(吡唑醚菌酯 + 50 mg/L 水楊羥肟酸)；0.1、0.5、1、2、5 mg/L(吡噻菌胺)。在培養4 d的炭疽菌PDA平板打取菌碟，接種到含藥平板，以含有等體積溶劑的平板為對照，每個處理重復3～5皿，試驗重復2次， 28 ℃培養4 d后測量各處理的菌落直徑，計算菌絲生長抑制率。利用DPS軟件建立藥劑濃度對數(x)與菌絲生長抑制機率值(y)之間的毒力回歸方程y= ax+ b，計算有效抑制中濃度(EC50)及相關系數。

2 結果與分析

2.1 病原菌的分離及形態學鑒定

從云南西雙版納地區景洪市和勐臘縣橡膠林采集的橡膠樹炭疽病病葉各20份。經分離純化獲得菌絲形態特征疑似炭疽菌的菌株共37株，其中景洪市19株，編號為JH1至JH19，勐臘縣18株，編號為M1至M18。37株菌株的菌落具有一致的形態特征，菌落棉絮狀，菌絲初期呈白色，培養第5天時，菌落中間出現橘色孢子堆，產生分生孢子。由于JH3和JH5菌株未產孢，對其余35個菌株進行了分生孢子形態鑒定，分生孢子單胞，無色，內含1個或2個或多個油球，大小為(9.8～17.5)μm ×(2.9～4.8)μm，初步鑒定這35個菌株均屬于炭疽菌Colletotrichum(圖1)。其中23個菌株的分生孢子兩端鈍圓，12個菌株分生孢子一端尖銳，符合膠孢炭疽菌復合群和尖孢炭疽菌復合群的特征，具體種屬有待于進一步分子鑒定。

2.2 病原菌的致病性檢測

將35個菌株的分生孢子接種健康橡膠樹葉片，36 h后即發病，接種癥狀與田間發病癥狀相似。分離純化發病葉片中的菌株，發現其與原接種菌株具有相同的形態特征。根據柯赫氏法則，判定這35個菌株為橡膠樹炭疽病的致病菌(圖2)。

2.3 系統發育樹分析

以上述35個菌株的基因組DNA為模板，擴增ITS、 ACT、TUB、GAPDH和CHS-1基因并測序。將測序所得序列經 NCBI 數據庫序列對比后確定該35株菌株同屬于炭疽菌屬，比對結果與形態學鑒定結果一致。選取了包括已報道的橡膠樹炭疽菌菌株在內的共31個菌株基因序列作為參考序列[8]，利用ITS、ACT、TUB、GAPDH、CHS-1五個基因的拼接序列，以鄰接法構建系統發育樹(圖3)。結果表明，35株炭疽菌可分為4個種，分別為膠孢炭疽菌復合群下的C.siamense，尖孢炭疽菌復合群下的C.laticiphilum和C.wanningense，以及新種C.cliviae。這是C.cliviae在云南地區橡膠樹炭疽病菌中的首次報道。測序菌株中有22株屬于孢炭疽菌復合群，占比63%，且均為C.siamense菌株。有12株屬于尖孢炭疽菌復合群，占比34%，其中4株為C.laticiphilum菌株，8株為C.wanningense菌株。

2.4 5種殺菌劑對橡膠樹C.cliviae菌株的室內毒力測定

5種殺菌劑對橡膠樹C.cliviae菌株的菌絲生長具有不同程度的抑制效果，EC50為0.075～1.090 mg/L(表1)。5種殺菌劑抑制效果大小依次為咪鮮胺、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲環唑和吡噻菌胺。5種殺菌劑對海南HN16菌株和云南M3菌株抑制效果相當，EC50差值不超過0.08 mg/L。

3 討論

炭疽病是我國橡膠樹的重要葉部病害之一，其病原物炭疽菌種類繁多，遺傳多態性豐富，不同種間形態和保守基因序列差異小，給分類鑒定工作造成了很大困難。采用形態學鑒定和rDNA-ITS序列分析的方法對炭疽菌的鑒定僅局限于復合群水平，對復合群中種的鑒定能力不足[15-16]。多基因系統進化分析技術很好地解決了炭疽菌分類上的困難。Damm等基于TUB、GAPDH、CHS-1基因序列的進化分析方法成功地鑒定出尖孢復合群中的Colletotrichumlaticiphilum[17]。Hunupolagama等利用ITS、GAPDH、TUB基因序列的進化分析方法明確了斯里蘭卡地區橡膠樹尖孢炭疽菌復合群中的種類別[18]。Liu等采用ITS、ACT、TUB、GAPDH、CHS-1基因序列的進化分析方法對我國橡膠樹膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌復合群下的種進行了鑒定和分類[8]。本研究采用形態學和多基因系統進化分析相結合的鑒定方法，闡明了我國云南西雙版納地區的橡膠樹炭疽病菌的種屬分類與優勢種。

本研究成功鑒定出云南西雙版納地區35株橡膠樹炭疽病菌，其中63%為膠孢炭疽菌復合群，34%為尖孢炭疽菌復合群。Cao等發現海南地區橡膠樹炭疽病菌中有78%為膠孢炭疽菌復合群，22%為尖孢炭疽菌復合群[7]。由此可見，我國云南和海南地區的橡膠樹炭疽病菌種群比例差異不大，優勢種群均為膠孢炭疽菌復合群。此外，在云南西雙版納地區發現的膠孢炭疽菌復合群中的菌株均屬于C.siamense，說明該病原菌是云南西雙版納地區橡膠樹炭疽病菌的優勢種，與此前報道的C.siamense為我國橡膠樹膠孢炭疽菌復合群中的優勢種相一致[8]。Shi等在我國云南地區首次發現了橡膠樹炭疽病菌C.laticiphilum菌株[19]，本次鑒定的尖孢炭疽菌復合群中有4個菌株也屬于C.laticiphilum。已有研究表明，C.laticiphilum是我國橡膠樹尖孢炭疽復合群的主要種之一[8-9]。此前有報道在云南紅河和德宏地區發現橡膠樹炭疽病菌C.boninense[20]，在德宏地區發現橡膠樹炭疽病菌發現C.karstii[21]，本研究未在西雙版納地區未發現這兩種炭疽菌，可見其引起的炭疽病尚處于零星發生狀態。另外，Cao等在我國海南地區首次發現了橡膠樹尖孢炭疽菌復合群下的C.wanningense菌株[10]，本研究在云南地區橡膠樹上同樣發了8個C.wanningense菌株。由此可見，我國橡膠樹炭疽菌種類地域性差異不大，但與斯里蘭卡的橡膠樹炭疽菌種類明顯不同[18]，這可能與氣候和種植品種不同有關，其地域分布差異性有待于進一步研究。近期本實驗室在海南地區發現的HN16菌株是首次在我國報道的橡膠樹C.cliviae[11]。本研究也成功分離出1個C.cliviae菌株M3，此為云南地區橡膠樹C.cliviae的首次發現，這說明C.cliviae可能已在我國植膠區分布廣泛。為了預防新種C.cliviae可能引起的橡膠樹炭疽病危害，本研究測定了5種殺菌劑對橡膠樹C.cliviae菌株M3和HN16的室內毒力。結果表明，麥角甾醇合成抑制劑類、甲氧基丙烯酸酯類、琥珀酸脫氫酶抑制劑類這三種殺菌劑對C.cliviae均有良好的菌絲生長抑制作用，EC50值不大于1.09 mg/L，其中咪鮮胺抑制效果最佳，EC50值為0.075～0.084 mg/L。咪鮮胺是我國防治橡膠樹炭疽病的重要藥劑之一。2017年的室內毒力測定結果表明，咪鮮胺對35株橡膠樹膠孢炭疽菌和20株橡膠樹尖孢炭疽菌的菌絲生長抑制EC50值均小于0.08 mg/L[7]。綜上所述，咪鮮胺對我國橡膠樹炭疽病菌的抑制活性依然良好，尚可繼續用于橡膠樹炭疽病的防治。