秸稈覆蓋還田對桑園土壤真菌群落結構組成的影響

肖 健，吳銀秀，楊尚東，屈達才

(廣西大學農學院/廣西大學蠶學研究所，廣西 南寧 530004)

【研究意義】桑樹(MorusalbaL.)是我國重要的經濟作物之一，其種質資源量穩居世界第一[1]。廣西作為我國最大的桑蠶生產基地，無論是桑園面積還是蠶繭產量均連續多年位居全國首位，其中，2018和2019年桑園面積分別為22.85萬和19.72萬hm2，蠶繭產量分別達40.44萬和37.4萬t[2-3]。但廣西桑園管理普遍存在盲目施用氮肥而導致的氮、磷、鉀肥施用比例失調等問題，不僅造成桑園土壤肥力下降，而且引起桑園土壤健康狀況失衡致使桑葉產量下降和品質劣化，嚴重制約廣西桑蠶產業的可持續發展[3]。秸稈還田不僅有助于提升土壤肥力，還能有效減少化肥施用量和提高農產品品質[4]。土壤微生物是土壤生態系統的重要組成部分，在物質循環和能量轉換中發揮著重要作用，是秸稈分解、轉化及土壤中能量和養分循環的關鍵因素[5]。已有研究表明，秸稈覆蓋還田可豐富小麥[6]、玉米[7]、水稻[8]和油菜[9]等作物的田間土壤肥力和真菌群落多樣性，但目前秸稈還田技術尚未在南方桑園推廣應用。因此，分析秸稈覆蓋還田對桑園土壤真菌多樣性的影響，對優化桑園施肥管理措施、保障桑園土壤健康及提升桑葉產量和品質具有重要意義。【前人研究進展】胡洪濤等[4]研究表明，與對照(CK)相比，油菜秸稈還田土壤中子囊菌門(Ascomycota)、結合菌門(Zygomycota)和壺菌門(Chytridiomycota)等真菌門的相對豐度明顯增加，樹粉孢屬(Oidiodendron)、核盤菌屬(Sclerotinia)、羊肚菌屬(Morchella)、外囊菌屬(Taphrina)、粉紅螺旋聚孢霉(Clonostachys)、隱球菌屬(Cryptococcus)、濕傘屬(Hygrocybe)、被孢霉屬(Mortierella)和Occultifur的相對豐度均顯著增加。梅沛沛等[9]研究表明，在酸性土壤上，以水稻秸稈粉碎后與土壤混勻再還田方式進行的秸稈還田有利于土壤中真菌數量增加及養分分解和轉化速率提高，使各生育時期油菜植株生物量顯著增加。Su等[10]研究發現，兩季作物秸稈還田后，其土壤細菌和真菌的相對豐度分別增加1.9%和7.7%，與土壤硝化相關的細菌相對豐度得到提高，但鏈格孢屬(Alternaria)的相對豐度降低。李鵬等[11]研究認為，水稻秸稈還田可顯著增加田間土壤的真菌群體數量和多樣性指數，還可促使土壤中富集具有較強纖維素分解能力的真菌(如青霉菌和曲霉菌)。張紅等[12]研究結果顯示，不同種類秸稈還田對微生物群落的影響存在差異，其中玉米秸稈還田土壤的微生物群落密度顯著高于大豆秸稈。李月等[13]研究發現，長期秸稈還田配施化肥處理可顯著增加彎孢菌屬(Curvularia)、籃狀菌屬(Talaromyces)、赤霉菌屬(Gibberella)、鐮刀菌屬(Fusarium)、被孢霉屬、毛殼菌屬(Chaetomium)和枝頂孢屬(Acremonium)的相對豐度，相對豐度的增加對改良農田土壤生態環境意義重大。紀程等[14]研究發現，秸稈還田可提高稻麥輪作土壤中子囊菌門及裂殼菌屬(Schizothecium)、帚枝霉屬(Sarocladium)、赤霉菌屬、囊根壺菌屬(Rhizophlyctis)、漆斑菌屬(Myrothecium)和隱球菌屬(Cryptococcal)等潛在秸稈降解真菌的相對豐度，還能通過富集潛在秸稈降解真菌加速麥稈降解。但也有研究結果顯示，新鮮秸稈還田會對土壤健康產生負面影響，對作物品質和產量提高產生限制作用[1]。因此，科學的秸稈還田應避免采用新鮮秸稈還田方式。【本研究切入點】至今，尚缺乏秸稈覆蓋還田對桑園土壤真菌群落影響的研究報道。【擬解決的關鍵問題】基于高通量測序技術，對比分析秸稈覆蓋還田桑園和非秸稈覆蓋還田桑園土壤真菌的多樣性，評價秸稈覆蓋還田技術對桑園土壤健康的作用機制，為優化桑園施肥管理措施、保障桑園土壤健康及構建可持續發展的桑樹栽培管理技術體系提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況及試驗材料

試驗于2020年5月3日至6月18日在廣西大學農學院蠶桑教學實習基地(東經108°17′14″，北緯22°51′17″)進行，該基地土壤類型為赤紅壤，pH 5.79，含有機質6.75 g/kg、全氮0.84 g/kg、全磷0.53 g/kg、全鉀14.54 g/kg、堿解氮57.45 mg/kg、速效磷3.39 mg/kg和速效鉀81.77 mg/kg。供試桑樹品種為桂桑12號，樹齡6年，采集其根區土壤樣品為試驗材料。

1.2 試驗設計

采用隨機區組設計，設秸稈覆蓋還田桑園(SR)和非秸稈覆蓋還田桑園(CK)2個處理。其中，SR處理是將干燥水稻秸稈切碎后直接覆蓋于桑樹根部的土面上，CK除未進行秸稈覆蓋外，其余田間管理措施與SR處理相同。每個小區處理面積15 m2，6次重復。秸稈覆蓋還田期間，平均氣溫約22 ℃，雨熱同期。處理45 d后(2020年6月18日)分別采集SR處理和CK桑園0～30 cm土層的土壤樣品。每處理隨機選擇6個土壤取樣點，土樣用無菌密封袋收集后放入冰盒帶回實驗室，置于-80 ℃冰箱保存。干冰保存送至測序公司提取DNA，進行高通量測序。

1.3 土壤真菌高通量測序

DNA抽提和PCR擴增：參照Fast DNA?SPIN Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，U.S.)操作說明進行土壤總DNA抽提，使用NanoDrop 2000分光光度計(Thermo fisher ccientific，美國)檢測DNA濃度和純度，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量，并以提取的土壤微生物DNA為模板，選用ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)為引物對真菌ITS區進行PCR擴增。使用常規方法回收PCR產物，并進行純化和檢測定量。

Illumina MiSeq測序：將同一樣本的PCR產物混合后以2%瓊脂糖凝膠回收PCR產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen biosciences，Union City，CA，美國)進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后用QuantusTMFluorometer(Promega，美國)對回收產物進行檢測定量。基于Illumina MiSeq平臺標準操作規程，以純化后的擴增片段構建文庫。利用Illumina公司的MiSeq PE300平臺進行測序(上海美吉生物醫藥科技有限公司)。

1.4 土壤真菌群落結構分析

土壤真菌群落結構分析包括土壤真菌的Alpha多樣性分析、門分類水平分析、屬分類水平分析、SR處理對桑園土壤真菌群落結構的影響和真菌FUNGuild功能預測。原始測序序列利用Trimmomatic進行質控；使用FLASH進行拼接，設置50 bp的窗口，去除質控后長度低于50 bp的序列，根據重疊堿基Overlap將兩端序列進行拼接，根據序列首尾兩端的Barcode和引物將序列拆分至每個樣本；使用UPARSE version 7.1(http://drive5.com/uparse/)根據97%的相似度對序列進行OTU聚類并剔除嵌合體，生成OTU表格；利用RDP classifier(http://rdp.cme.msu.edu/)對每條序列進行物種分類注釋，比對ITS數據庫，設置分類置信度為0.7。獲得分類學信息和各樣本在各分類水平上的群落組成，用圖形進行可視化表示，使用Usearch和Mothur分別進行OTU豐度和Alpha多樣性計算，得到樣品物種信息；以LEfSe根據分類學組成對樣本按照不同的分組條件進行線性判別分析(LDA)，找出對樣本劃分產生顯著性差異影響的群落或物種；利用FUNGuild，根據真菌群落對同類環境資源的利用途徑進行功能預測。

1.5 統計分析

試驗數據采用Excel 2019進行統計，以SPSS 21.0進行方差分析，以Duncan’s新復極差法進行差異顯著性檢驗，并利用上海美吉生物醫藥科技有限公司的生信云分析平臺(https://cloud.majorbio.com)進行在線數據分析。

2 結果與分析

2.1 秸稈覆蓋還田土壤真菌的Alpha多樣性

由表1可知，桑園土壤樣品的覆蓋率均在99.0%以上，說明分析數據真實可信；SR土壤中，指示真菌豐富度的Ace指數和Chao1指數均高于CK土壤，但二者間無顯著差異(P>0.05，下同)；指示真菌多樣性的Shannon指數以CK高于SR土壤，但二者間也無顯著差異。說明秸稈覆蓋還田未改變桑園土壤真菌的多樣性和豐富度。

2.2 桑園土壤真菌群落結構組成分析

2.2.1 門分類水平的分析結果 在門分類水平，將相對豐度占比大于1.00%的真菌門類定義為優勢真菌門。從圖1可看出，SR處理土壤的優勢真菌門類分別為子囊菌門(Ascomycota,83.00%)、擔子菌門(Basidiomycota，11.83%)、被孢霉門(Mortierellomycota，2.60%)和unclassified_k__Fungi(2.02%)，CK土壤的優勢真菌門類分別為子囊菌門(58.79%)、擔子菌門(21.93%)、unclassified_k__Fungi(11.83%)、被孢霉門(4.09%)和球囊菌門(Glomeromycota，2.69%)。其中，子囊菌門、擔子菌門、被孢霉門和unclassified_k__Fungi是SR處理和CK土壤中的共有優勢真菌門類，而子囊菌門具有降解纖維素和木質素的能力，可通過降解纖維素和木質素為桑樹健康生長提供所需的營養和肥力。

表1 秸稈覆蓋還田土壤真菌的多樣性和豐富度

2.2.2 桑園土壤真菌屬分類水平分析結果 在屬分類水平，將相對豐度占比大于1.00%的真菌屬定義為優勢真菌屬。從圖2可看出，SR處理和CK土壤中相對豐度占比大于1.00%的優勢真菌屬數分別為23和21個。其中，SR處理土壤優勢真菌屬為unclassified_f__Microascaceae(10.62%)、Apiotrichum(8.37%)、木霉屬(Trichoderma，6.45%)、unclassified_o__Hypocreales(5.25%)、鐮刀菌屬(Fusarium，5.23%)、腐質霉屬(Humicola，4.83%)、Plectosphaerella(4.20%)，Chordomyces(4.18%)、曲霉屬(Aspergillus，4.12%)、新赤殼屬(Neocosmospora，3.93%)、Roussoella(3.62%)、籃狀菌屬(Talaromyces，3.57%)、Gibellulopsis(3.17%)、被孢霉屬(Mortierella，2.53%)、unclassified_o__Pleosporales(2.05%)、unclassified_k__Fungi(2.02%)、杯盤菌屬(Ciboria，1.67%)、unclassified_c__Sordariomycetes(1.42%)、支頂孢屬(Acremonium，1.35%)、unclassified_p__Ascomycota(1.31%)、毛孢子菌屬(Trichosporon，1.23%)、毛殼菌屬(Chaetomium，1.11%)、假埃希氏菌屬(Pseudallescheria，1.09%)和其他(others)(14.97%)；CK土壤優勢真菌屬為Saitozyma(14.71%)、unclassified_k__Fungi(11.84%)、木霉屬(8.36%)、unclassified_c__Eurotiomycetes(4.83%)、鐮刀菌屬(4.27%)、新赤殼屬(3.98%)、籃狀菌屬(3.86%)、被孢霉屬(3.39%)、毛殼菌屬(2.89%)、Sistotrema(2.63%)、Gibellulopsis(2.40%)、unclassified_c__Sordariomycetes(2.15%)、Roussoella(1.73%)、青霉屬(Penicillium，1.68%)、unclassified_o__Xylariales(1.38%)、unclassified_p__Ascomycota(1.37%)、馬利亞霉屬(Mariannaea，1.37%)、Chordomyces(1.35%)、unclassified_o__Pleosporales(1.35%)、Plectosphaerella(1.13%)、粉褶菌屬(Entoloma，1.02%)和其他(others)(20.33%)。可見，秸稈覆蓋還田可使桑園土壤的優勢真菌群落相對豐度占比發生改變，其中，缺失Saitozyma，unclassified_c__Eurotiomycetes、Sistotrema、青霉屬、unclassified_o__Xylariales、馬利亞霉屬和粉褶菌屬等優勢真菌屬，但富集unclassified_f__Microascaceae、Apiotrichum、unclassified_o__Hypocreales、腐質霉屬、曲霉屬、杯盤菌屬、支頂孢屬、毛孢子菌屬和假埃希氏菌屬等特有優勢真菌屬，而腐質霉屬(Humicola)、曲霉屬(Aspergillus)和支頂孢屬(Acremonium)等秸稈降解真菌的富集有利于加速秸稈降解，保障桑樹植株土壤養分均衡供給，有利于桑樹健康生長發育。

2.3 秸稈覆蓋還田對桑園土壤真菌群落結構的影響

物種進化分支圖(圖3-A)可從內圈到外圈依次展示樣本群落中從門到屬的所有等級關系及各分類單元在不同處理間的差異情況。基于LDA值分布柱狀圖(圖3-B，篩選標準為P<0.05，LDA score>4.0)可知，在門分類水平，子囊菌門真菌是SR處理土壤中相對豐度占比最大的優勢真菌門類，unclassified_k__Fungi和球囊菌門是CK土壤中相對豐度占比前2位的優勢真菌門類；在屬分類水平，unclassified_f__Microascaceae、Apiotrichum、unclassified_o__Hypocreales和腐質霉屬是SR處理土壤中相對豐度占比排名前4位的優勢真菌屬，Saitozyma、unclassified_k__Fungi和unclassified_c__Eurotiomycetes是CK土壤中相對豐度占比排名前3位的優勢真菌屬。說明秸稈覆蓋還田處理土壤中子囊菌門和腐質霉屬等秸稈降解真菌的相對豐度占比明顯增加，從而有利于加速秸稈降解，為桑樹生長發育提供所需的營養和肥力。

2.4 真菌FUNGuild功能預測

利用FUNGuild，根據真菌群落對同類環境資源的利用途徑進行功能預測。從圖4可看出，SR處理和CK土壤的真菌可劃分為共生營養型(Symbiotroph)、病理營養型(Pathotroph)和腐生營養型(Saprotroph)3種類型及15個Guilds，其中，主要包括植物病原真菌(Plant pathogen)、未定義腐生菌(Undefined saprotroph)、不明真菌(unknown)、土壤腐生真菌(Soil saprotroph)、凋落物腐生真菌(Litter saprotroph)、糞腐真菌(Dung saprotroph)、體表寄生菌(Epiphyte)、植物腐生真菌(Plant saprotroph)、地衣寄生真菌(Lichen parasite)、木質腐生真菌(Wood saprotroph)、寄生真菌(Fungal parasite)、動物病原菌(Animal pathogen)、叢枝菌根真菌(Arbuscular mycorrhizal)、外生菌根(Ectomycorrhizal)和內生真菌(Endophyte)。可見，與CK相比，秸稈覆蓋還田桑園土壤中富集了相對豐度更為豐富的腐生營養型真菌，更有利于提高土壤肥力，促進桑樹生長。

3 討 論

秸稈覆蓋還田具有培肥、蓄水、調溫、增產及減少污染等作用，能有效改善農田生態環境、培肥地力和提高作物品質與產量。因此，在我國南方桑園開展秸稈覆蓋還田技術研究，對構建穩定高產、可持續發展的桑樹栽培管理體系具有重要意義[1]。植物根系、土壤及土壤根際微生物所形成的根際微生態系統通常維持著動態平衡[8]。微生物是生態系統中功能活躍并具有開發潛力的寶貴生物資源庫[15]。土壤中豐富的微生物多樣性在陸地生態系統中發揮非常重要的功能，微生物群落多樣性越豐富、物種越均勻、群落結構越穩定時，植物對抗病原菌的綜合能力就越強[16]。王妍[17]研究發現，免耕秸稈還田、焚燒秸稈還田和火糞秸稈還田對土壤真菌豐富度指數和多樣性指數均無顯著影響。本研究亦發現，秸稈覆蓋還田下指示桑園土壤真菌豐富度的Ace和Chao1指數及指示真菌多樣性的Shannon指數與非秸稈覆蓋還田桑園相比均無顯著差異。

已有研究證實，子囊菌能降解纖維素和木質纖維素[5，18]；麥稈還田后土壤的優勢真菌門類主要為子囊菌門、接合菌門和擔子菌門[17-19]；無論是短期的培養試驗還是長期的定位試驗，秸稈還田后子囊菌門真菌的相對豐度均顯著增加[20-21]。本研究同樣發現，在門分類水平，子囊菌門和擔子菌門真菌是秸稈覆蓋還田桑園土壤的優勢真菌門類，秸稈覆蓋還田桑園土壤中子囊菌門真菌的相對豐度顯著高于非秸稈覆蓋還田桑園土壤。

本研究結果表明，在屬分類水平，Saitozyma、unclassified_c__Eurotiomycetes、Sistotrema、青霉屬、unclassified_o__Xylariales、馬利亞霉屬和粉褶菌屬等均為非秸稈還田桑園土壤特有的優勢真菌屬，unclassified_f__Microascaceae、Apiotrichum、unclassified_o__Hypocreales、腐質霉屬、曲霉屬、杯盤菌屬、支頂孢屬、毛孢子菌屬和假埃希氏菌屬等是秸稈覆蓋還田桑園土壤特有的優勢真菌屬。楊順等[22]研究表明，曲霉屬真菌具有溶磷、促生長作用，腐質霉屬真菌具有降解纖維素和木質纖維素促進植株根系吸收養分、保障植株根際土壤養分均衡供應微環境作用[23]，支頂孢屬真菌具有較高的纖維素酶分泌能力[24]和強化宿主植株根際微環境生防能力[25]。本研究中，秸稈覆蓋還田桑園土壤富集了相對豐度占比更高的子囊菌門真菌及腐質霉屬、曲霉屬和支頂孢屬等特有優勢真菌屬，表明秸稈覆蓋還田能通過富集潛在秸稈降解真菌加速秸稈降解，保障桑樹植株土壤養分均衡供給，有利于桑樹健康生長發育。

4 結 論

與非秸稈還田桑園土壤相比，秸稈覆蓋還田桑園土壤中富集了腐質霉屬、曲霉屬和支頂孢屬等特有優勢有益真菌屬，有助于維護桑園土壤健康，有效保障桑樹健康生長。