迪溝采煤沉陷區水體中人體腸道病原菌致病基因豐度變化及其影響因素

楊夢瑤，張明珠，汪 穎，孫慶業*

(1.安徽大學資源與環境工程學院，安徽 合肥 230601；2.濕地生態保護與修復重點實驗室，安徽 合肥 230601)

【研究意義】人類社會的可持續發展離不開豐富的水資源，但隨著人類各項開發開采活動的進行，可利用的淡水資源正在急劇減少并受到了嚴重污染[1]，目前，水資源的緊缺和污染已經成為一個全球性問題，我國的水資源現狀更是不容樂觀。資料顯示，我國四大流域近90%的湖泊都已呈現出富營養化狀態，有過半比例的城鎮水源已不符合飲用水水質標準，近40%的水源已完全無法使用，對居民健康造成了嚴重威脅[2]。人類活動對水資源造成的污染主要包括生活污染、工業型污染和農業污染等，污染物的排入在加劇水體富營養化的同時也為水體中病原微生物的生長繁殖提供了條件，相關數據表明，飲用水是全世界傳染病最主要的傳播媒介之一[3]。通過水體傳播的疾病，如痢疾、腹瀉、霍亂等，均與其中的腸道致病菌有關。常見的人體腸道致病菌有腸炎沙門氏菌[4]、志賀氏菌[5]、致病性大腸埃希氏菌[6]等，這些細菌侵入人體后會對腸道造成損傷，導致疾病。例如，一些大腸桿菌菌株通過產生外毒素來誘發分泌性腹瀉，沙門氏菌血清可侵入腸道上皮細胞，對上皮造成神經性損傷并使其喪失粘膜屏障完整性，最終導致″炎癥性腹瀉″[7]，因此，針對水體中人體腸道病原微生物的研究已經引起人們的廣泛重視，這對保護人體健康具有重要意義。【前人研究進展】目前，國內外對致病基因的研究多集中于水體[8-9]、土壤[10-12]以及食品[13-14]中幾種致病基因的檢測或各類抗生素對其產生的影響[15-17]，而針對采煤沉陷區水體中不同人體腸道病原菌致病基因受不同污染物影響后的豐度差異研究開展較少。在采煤過程中，地面形成大面積沉降，較高的地下水位和周邊的河流會導致大面積沉陷積水區的形成[18]。由于沉陷區與外界的循環較少，外界污染物排入后會在水體中富集，化學肥料和農藥、煤結塊浸出及周邊畜牧養殖廢水等，都是沉陷區水體污染的主要來源，而上覆水和沉積物形成的動-靜系統不僅會使沉積物中的養分釋放到上覆水中隨水體流動不斷擴散，上覆水中的營養物質也會隨著水流逐漸富集至沉積物中[19]，這樣的物質交換會對水體中人體腸道病原微生物的空間分布產生影響。【本研究切入點】本研究以皖北地區采煤沉陷區中幾種受到不同污染的水體為研究對象，采用qPCR[20-21]等現代分子生物學方法，分析上覆水和沉積物的基本理化性質及其中五種人體腸道病原菌致病基因的相對豐度差異，以已知飲用水源地董鋪水庫為參照系。【擬解決的關鍵問題】探究迪溝采煤沉陷區水域作為飲用水源地的合適性，為皖北缺水地區的水資源保護和利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 研究區概況 研究區是位于安徽省阜陽市迪溝采煤沉陷區(116°19′31″～116°26′38″E，32°45′57″～32°48′42″N)的大面積湖區及周邊入湖河流，該區域屬暖溫帶半濕潤季風氣候，夏熱冬寒，四季分明，光照充足，雨量適中，年平均氣溫14.7 ℃，年均降水量950 mm，年均無霜期221 d。

對照區是位于安徽省合肥市的已知水源地董鋪水庫(117°05°48″～117°12′22″E，31°51′40″～31°55′33″N)。

1.1.2 樣品采集 2019年10月，在安徽省阜陽市迪溝采煤沉陷區的湖區及河流中采集35個上覆水和沉積物樣品(圖1、表1)。同年同月，在安徽省合肥市董鋪水庫的中心區域采集5個上覆水和沉積物樣品。上覆水樣品由經高溫高壓滅菌的玻璃瓶保存于4 ℃冰盒中，沉積物樣品由高溫滅菌自封袋臨時保存，帶回實驗室經真空冷凍干燥后備用。

1.1.3 供試菌種 5株標準菌株腸炎沙門氏菌CMCC(B)50041、志賀氏菌CMCC(B)51571、小腸結腸炎耶爾森菌CMCC(B)52204、糞腸球菌ATCC29212、O157：H7大腸埃希氏菌800014均購于中國醫學細菌保藏管理中心(National Center for Medical Culture Collections)。

1.2 試驗方法

1.2.1 上覆水理化性質的測定 pH值、電導率、溶解氧分別用pH儀、便攜式電導率儀和便攜式溶解氧儀器現場測定，硝氮用紫外分光光度法測定，氨氮用水楊酸分光光度法測定，總氮用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定，總磷用鉬酸銨分光光度法測定，CODMn的測定依據國標ISO 8467—1986。

1.2.2 沉積物理化性質的測定 pH用pH儀測定，總氮用凱氏定氮儀測定，總磷用硫酸—高氯酸消煮—分光光度法測定，氨氮用苯酚—次氯酸鈉分光光度法，硝氮紫外分光光度法測定，Zn、As、Cd、Pb、Cu的含量采用電感耦合等離子體質譜儀(ICAPQ，Thermo Fisher，美國)測定。

1.2.3 DNA提取和標準品制備 DNA提取：每個樣點取100 mL上覆水樣品，在超凈工作臺中真空抽濾，將上覆水中的微生物收集到0.22 μm的濾膜上，置于-20 ℃冰箱保存，最后用經過滅菌的剪刀剪碎，用CTAB法(十六烷基三甲基溴化銨法，Cetyltrimethylammonium Bromide)提取濾膜上的微生物總DNA；每個樣點稱取0.5 g的沉積物樣品，亦用CTAB法提取微生物總DNA。標準菌株DNA的提取：將0.5 mL液體培養基注入裝有菌種凍干粉的安瓿中，輕吹吸使溶解并制成細菌懸液，將細菌懸浮液接種到50 mL液體培養基并在37 ℃的恒溫震蕩培養箱中培養18～24 h至菌液渾濁。最后使用Bacterial DNA Kit D3350-1試劑盒提取菌液基因組DNA。標準品制備：以標準菌株的基因組DNA為模板，使用Bio-rad thermal cycler進行PCR擴增(引物序列見表2)，擴增產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后使用Gel Extraction Kit試劑盒進行凝膠切割和純化過程。在克隆過程中，將純化的PCR產物連接到T3載體，并導入到Trance 1-T1大腸桿菌化學感受態細胞中使其連接，注入150 μL液體培養基于37 ℃搖床中震蕩1 h，最后將菌液均勻地涂在培養皿中并培養12～15 h，篩選出陽性克隆的質粒，在LB液體培養基中培養大約6 h后，經M13引物擴增檢測后送至華大基因公司測序，測序結果通過BLAST比對驗證，最后用M13引物擴增，在凝膠成像儀中切割2%凝膠中的目標產物，并用試劑盒純化，于-20 ℃冰箱中保存。

1.2.4 qPCR反應 使用SYBR Green染料進行了qPCR反應，擴增條件在檢測分析之前針對每個基因進行了優化。最終確定的體系如下：總反應體系為10 μL，包括5 μL SYBRFAST qPCR Kit Master Mix，稀釋10倍的DNA模板2 μL，上下游引物(100 μmol/L)各0.2 μL，加ddH2O至10 μL。 qPCR反應參數為：95 ℃變性3 min，隨后進行40個循環，其中95 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s、72 ℃延伸45 s，在72 ℃時收集熒光信號。設置溶解曲線的條件為：95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃15 s。每個基因均已稀釋10倍濃度梯度的標準品作為模板進行qPCR熒光定量以繪制標準曲線，qPCR的擴增效率為85%～95%，標準曲線的R2>0.99。

表1 研究區采樣點分布區域概況

表2 研究所用引物序列

1.2.5 數據統計分析 用SPSS 23.0軟件對數據進行單因素方差分析，并用Duncan法進行差異顯著性檢驗，差異顯著水平為0.05；用Arcgis 10.2軟件的IDW反距離權重插值法繪制空間分布圖；用Canoco 4.5做RDA分析。

2 結果與分析

2.1 上覆水理化性質

研究區及對照區上覆水理化性質分析結果見表3。研究區內上覆水平均pH為7.97，屬弱堿性水，硝氮、氨氮、總氮、總磷含量及高錳酸鉀指數分別是對照區的3.17、5.94、5.57、5.58和1.52倍，均顯著高于對照區，較對照區污染嚴重。研究區4個區域的污染程度由大到小依次是養殖廢水污染區>生活污水污染區>其他污染區>煤矸石污染區，其中受到養殖廢水影響的區域的氨氮和總磷含量是其他3個區域的3.09倍。依照《地表水環境質量標準》(GB 3838—2002)及綜合水質標識指數法評價后，董鋪水庫上覆水達到Ⅱ類綜合水質級別，而迪溝采煤沉陷區上覆水只達到了Ⅳ類和Ⅴ類綜合水級別。

2.2 沉積物理化性質

表4顯示，研究區內沉積物平均pH為8.02，呈弱堿性，氨氮、總氮和總磷污染嚴重，均顯著高于對照區，受到的重金屬污染主要來源于Zn、As和Cu。研究區4個區域的污染程度由大到小依次是養殖廢水污染區>煤矸石污染區>生活污染區>其他污染區，養殖廢水區的硝氮、總氮、總磷和Zn的含量是其他區域的2.89、2.30、1.65和3.4倍。對于總氮的單項污染指數評價，對照區屬清潔等級，研究區少數部分有輕度污染；對于總磷的單項污染指數評價，對照區屬清潔等級，研究區大部分地區有輕度和中度污染，其中樣點H7和DG27屬重度污染。

表3 上覆水理化性質

表4 沉積物理化性質

2.3 水體中病原菌致病基因豐度的空間分布

圖2～4表明，上覆水中致病基因的相對豐度(某一致病基因copies/16S rRNA copies)在0.09×10-4～9.83×10-4范圍，沉積物中的基因相對豐度在0.39×10-4～80.09×10-4范圍，整體比上覆水中高4～9倍，上覆水和沉積物中相對豐度最大的分別是ipaH和eae基因，相對豐度最小的均是ttr基因。上覆水中，受生活污水和煤矸石影響的區域中eae基因的相對豐度較大，是其他污染區域的2～4倍，受養殖廢水污染的水域ail、divIVA、ipaH和ttr基因的相對豐度均較高，是其他4個區域的2～6倍。沉積物中，受生活污水和其他農耕污染影響的水域中eae基因的相對豐度最大，是其他區域的3～5倍，受煤矸石污染的水中5種致病基因的相對豐度均較小，比其他區域低3～6倍，而受養殖廢水影響的水域中5種致病基因的相對豐度均明顯高于其他區域，是其他區域的3～6倍，污染最嚴重的是H7、H8兩個采樣點所屬的入湖河流。在空間分布上，上覆水受到的病原菌污染呈現出大面積分布，而沉積物受到的病原菌污染呈小面積分布。總的來說，上覆水受到病原菌污染的程度較沉積物中的更小，但污染面積更大，范圍更廣。

3 討 論

分子生物學技術的發展已逐漸替代了傳統的微生物培養和分離技術，qPCR技術具有快速、靈敏度高、特異性強等優點，在對病原菌致病基因定量分析的研究上得到廣泛應用[20-21]。Malorny等人收集了120份食物樣本，同時用傳統方法和qPCR技術檢測食物中的小腸結腸炎耶爾森菌，發現后者靈敏度更高[22]。本研究利用qPCR技術對研究區水體中病原菌致病基因相對豐度進行分析，結果表明，經不同污染源影響的水域均受到了不同程度的病原菌污染，且不同病原菌致病基因的相對豐度具有顯著的空間分布差異。生活污水和養殖廢水影響的水域受到了較大程度的病原菌污染，而煤矸石堆積區和其他區域受到的病原菌污染程度相對較小。

管理過量養分是改善水域生態系統的主要障礙，各種污染的排入使水體承受了高負荷的氮、磷壓力，過多的養分負載會導致水體富營養化[23]，畜牧業和家禽養殖業產生的動物糞便、有機化肥以及生活污水都是水體中氮和磷的來源。迪溝采煤沉陷區水體受到較嚴重的總氮和總磷污染，猜測這主要與周邊耕地施加有機化肥以及對污水排放的管理不當有關，相關研究表明，肥料的使用占城鎮水域氮輸入總量的37%～59%，動物糞便的排放養分投入占磷投入總量的76%及氮投入總量的28%[23]。

本研究中，受生活污水影響的水域受到了較嚴重的大腸桿菌污染，這可能和水域周邊農耕地使用有機肥料有關。相關研究表明有機肥料、牛肉牛奶制品和水果蔬菜是O157∶H7型大腸桿菌的重要來源[24-25]，該菌株通常被裂解為帶有一種或多種攜帶志賀毒素基因的噬菌體[26]，eae基因是O157∶H7型致病性大腸桿菌內膜蛋白基因[24]，這種病原體潛入水體后不僅使水體受到致病性大腸桿菌的污染，同時也會增加志賀氏菌的感染風險，Khandaghi等[27]的研究也表明有機肥料的大量使用會增加致病性大腸桿菌感染的風險。研究區中受生活污水影響的水域周邊分布著大面積的居民區和農耕地，這會使大量的居民生活污水和有機肥料進入水體，濟河(H1采樣點所屬河流)是一條從阜陽市區流入研究區的河流，H2和H3兩個采樣點分別位于兩條從附近城鎮流入研究區的河流(以下稱河2和河3)中，河3由北向南匯入湖區后在南邊的閘口處匯入濟河，河2由南向北匯入濟河后流入湖區，這樣的水體流動會使隨污染物潛入水體的大腸桿菌迅速擴散至研究區大面積水域。而DG1采樣點周圍的水域因受到水體流動的影響較小，流入湖區的污染物迅速沉淀至湖底，這導致該區域只有小面積的沉積物受到了較嚴重的大腸桿菌污染。

受養殖廢水影響的水域中，糞腸球菌、耶爾森菌和沙門氏菌的污染較嚴重。相關研究表明豬腸道中含有大量糞腸球菌、耶爾森菌和沙門氏菌[22,28-29]，divIVA基因是促使糞腸球菌細胞分裂、細胞生長和染色體分離的必需基因[30]，ail基因是致病性小腸結腸炎耶爾森菌的附著和侵襲基因[31]，ttr基因是腸炎沙門氏菌最主要的毒力因子[6]。動物養殖廠廢水的排放會加劇水體富營養化，弱堿性和高營養化的水環境為這3種病原微生物提供了巨大的棲息地，Schwaiger[32]和Bozcal[33]在豬腸道及豬糞樣品中分別分離出了糞腸球菌和小腸結腸炎耶爾森菌，并結合對當地水樣的分析，證實這兩種病原菌對公共健康具有潛在危害性。H7和H8兩個采樣點分別位于兩條源頭是家畜養殖場排污口的河流，研究區中受養殖廢水影響的水域主要接收來自研究區周邊養豬場廢水的污染，大量動物糞便隨河水直接流入湖區，污染物在流入湖區后會因入湖口處水流速度減緩而快速沉降至水底，導致沉積物受到的病原菌污染在空間上呈小面積分布。

分析上覆水和沉積物的理化性質與病原菌致病基因相對豐度的關系后發現，上覆水和沉積物的理化性質均對水體中5種致病基因的豐度產生影響。上覆水中總氮、溶解氧的含量和沉積物中總磷、Zn的含量分別對上覆水中eae基因和divIVA基因的相對豐度影響顯著。上覆水中COD和溶解氧的含量對沉積物中eae基因的相對豐度影響顯著，沉積物中總氮的含量對其中ipaH基因的相對豐度有顯著影響，Zn的含量對沉積物中divIVA和ail基因的相對豐度影響顯著。Lim等[34]的研究結果也證實了水體中大腸埃希氏菌群的數量和COD、總氮、總磷的含量呈極顯著正相關。研究區屬采煤沉陷區，塌陷區水域周邊及水底部均存在大量煤矸石的堆放及填埋，這會導致大量重金屬物質隨雨水沖刷及人類活動進入水體，周邊農耕活動使用的農藥化肥也會使重金屬元素潛入水體，對水體中的微生物群落造成影響。Jana等[35]發現隨著水體中重金屬元素含量的增加，大腸埃希氏菌的數量逐漸減少，本研究結果也表明沉積物中的重金屬元素含量與水體中eae基因的相對豐度呈負相關。Deng等[36]的研究也證實受到較大程度重金屬污染的土壤中，真菌和細菌的豐度明顯降低，微生物的活性、多度及豐度隨著重金屬含量的升高而降低。但本研究結果中Cu、Zn含量與divIVA、ail基因相對豐度之間的關系呈正相關，猜測這和微生物之間的相互作用及其自身產生抗性有關[37]，大多數的人體腸道病原微生物屬兼性厭氧菌，在溶解氧較低的污染水體中仍然可以快速繁殖，微生物可互相利用對方的代謝產物促進自身的繁殖作用[38]。相關研究表明，腸道病原菌在感染位置會聯合形成生物膜以增強對抗生素的耐受性[39]并且在重金屬負荷較高、污染較嚴重的環境中會產生抗性菌株[40]。因此，這些因素對其豐度變化產生的影響也同樣不可忽視。

4 結 論

迪溝采煤沉陷區水體中不同腸道病原菌的空間分布具有顯著差異，且上覆水和沉積物中病原菌的空間分布趨勢不一致。受生活污水影響的水域中，上覆水和沉積物中eae基因的相對豐度均較高；受煤矸石影響的水域中，上覆水中只有eae基因的相對豐度較高，沉積物中5種致病基因的相對豐度均較低；受養殖廢水影響的水域中，上覆水中只有eae基因相對豐度較低，沉積物中ail、divIVA、ttr基因的相對豐度均顯著高于其他區域；迪溝采煤沉陷區上覆水受到0157∶H7型大腸桿菌、腸炎沙門氏菌、志賀氏菌、糞腸球菌和耶爾森菌污染的程度較沉積物中的更小，但污染面積更大，范圍更廣；水體中氮、磷含量對人體腸道病原菌致病基因豐度產生顯著影響。理化性質分析結果和較高的人體腸道病原菌致病基因豐度均表明迪溝采煤沉陷區水域不適合作為飲用水源地，該地區生活污水及養殖廢水的排放應得到進一步的關注和管理。