日糧精粗比對育肥藏羊腸道真菌多樣性的影響

李蔣偉，周 力，侯生珍，王志有，雷 云，賈建磊，桂林生

(青海大學農牧學院，青海 西寧 810016)

【研究意義】腸道微生物對機體健康的影響機制是近年來研究的一大熱點，真菌在腸道菌群中相較于細菌占比較小，但是對維持腸道生態平衡發揮了重要作用[1]。目前腸道真菌與宿主間的互益關系并未有力證據被證明，而除了少數具有益生作用的真菌之外，腸道真菌多為致病菌，大量學者研究表明腸道真菌對炎癥性腸病、腹瀉等疾病有重要影響[2-4]。但對于反芻動物來說，真菌有利于挖掘高效纖維降解酶，而畜種、消化道類型和日糧結構等因素均能影響消化道真菌的組成。許多研究者發現草食動物消化道中存在大量好氧真菌,無論這些真菌是一過性還是長期定殖,它們在消化道中都行使了一定的纖維消化功能，且酵母綱所占比例高,具有潛在開發價值[6-8]。【前人研究進展】ISHAQ等[9]利用WHITE等[10]的引物擴增ITS1序列,通過高通量分析發現在奶牛瘤胃中存在著近50%的非嚴格厭氧真菌；當奶牛日糧精粗比升高誘導亞臨床酸中毒后,奶牛瘤胃中新美鞭菌屬、根囊鞭菌屬、梨囊鞭菌屬厭氧真菌的相對豐度顯著降低，而翹孢霉屬 (Emericella) 、鐮刀菌屬 (Fusarium) 、紅曲霉屬(Monascus) 、畢赤酵母屬 (Pichia) 、假絲酵母 (Candida) 等相對豐度有增加趨勢。【本研究切入點】ITS高通量測序技術利用其在不同菌種中序列的多樣性進而鑒定菌種的類別[11]，而使用高通量測序技術測定不同精粗比日糧對藏羊腸道真菌微生物菌群分布鮮有報道。【擬解決的關鍵問題】本試驗旨在探究早期斷奶藏羔羊育肥期日糧適宜的精粗配比，測定藏羊腸道真菌微生物分布特征，分析不同精粗比真菌菌群定植的影響，為藏羊日糧的合理配制和科學飼養提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗時間和地點

2019年5月15日至8月25日，在青海省海南州共和縣切吉鄉哇合村青海香咔梅朵牧業有限公司進行動物飼養試驗；2019年9月16日腸道食靡樣品交由百邁克生物科技公司進行真菌16S rDNA基因的測序工作。

1.2 試驗設計及飼養管理

選擇健康、體況相近的早期斷奶藏羊母羔共210只，隨機分成7組，每組30只。7組羔羊分別飼喂精粗比為80∶20(A組)、70∶30(B組)、60∶40(C組)、50∶50(D組)、40∶60(E組)、30∶70(F組)和20∶80(G組)的日糧；日糧精粗比為干物質比，各組精飼料完全一致，粗飼料由燕麥青干草與燕麥青貯按干物質比例1∶1混合而成。飼養試驗預飼期為10 d，正試期為90 d。藏羊未有現行飼養標準，參考NY/T 816—2004中國肉羊飼養標準[12]進行日糧配制，精飼料組成及營養水平如表1。

1.3 飼養管理

試驗羔羊全舍飼分欄飼養，分別于早晨8：30和下午16：30飼喂羔羊2次，日糧自由采食，自由飲水，每天飼喂前清掃殘留飼料并稱重。每天中午12：30定期清掃羊舍，保持羊舍衛生、通風和干燥，每周對羊舍和運動場進行2次消毒殺菌。試驗期對羔羊進行羊四聯、小反芻獸、口蹄疫和羊痘等疫苗的免疫注射，分別用伊維菌素和溴氰菊酯淋浴進行內外寄生蟲防治。

表1 精飼料組成及營養水平

1.4 腸道食靡采集與真菌分析方法

飼養試驗結束后，每組中隨機抽取3只試驗羊于清晨空腹屠宰，采集小腸食靡于5 mL離心管中，混勻、過濾后將濾液進行3500 r/min離心15 min，投入液氮，于實驗室-80 ℃冷凍保存。本試驗16SrDNA高通量測序部分交由百邁客生物科技有限公司測定，對采集到的21個腸道食靡樣品基于 Illumina HiSeq測序平臺，采用雙末端測序(Paired-End)的方法，構建小片段文庫進行測序，進一步對 Reads 拼接過濾，OTUs聚類分析，物種注釋及豐度分析。使用DNA提取試劑盒(InvitrogenTM，USA)提取瘤胃微生物基因組DNA，根據保守區設計得到引物，真菌通用引物為ITS1F：5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′ ITS2：5′-GCTGCGTTCTTCATC GATGC-3′。在引物末端加上測序接頭，進行PCR擴增并對其產物進行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進行文庫質檢，質檢合格的文庫進行高通量測序，進而得到原始圖像數據文件。PCR擴增步驟為：模板DNA經加熱至98 ℃左右持續 2 min，輪回30次循環，依次經過98 ℃×30 s、50 ℃×30 s、72 ℃×1 min，最后于72 ℃下延長7 min。

1.5 數據處理

采用Excel整理初始數據，用SPSS 20.0中的One-way ANOVA進行單因素方差分析，檢測結果用平均值±標準誤(Mean±SE)的形式表示。差異顯著的評斷標準為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 日糧精粗比對育肥藏羊腸道真菌微生物的影響

2.1.1 測序數據質量評估 參與測序21個育肥藏羊腸道食靡樣品共產生1524 066條Clean tags，每個樣品至少產生67 257條Clean tags，平均產生72 575條Clean tags。所有樣品測序覆蓋率均在99%以上，本試驗測序深度能夠準確反映藏羊瘤胃細菌的組成。

從圖1可以看出，在97%的物種相似度水平下，7組檢測樣本共得到499個OTU，其中有351個為7組共有OTU，占OTU總數比例的70.3%，獨有的OTU分別為12、15、10、11、76、6和18個，占總的OTU數較小，表明各組之間(除E組外)OTU組成差異較小，相似度較高；其中E組腸道真菌特有OTU最高，有76個；G組次之，有18個；F組特有OTU最少，有6個。

Rank-Abundance曲線可解釋7組樣品多樣性的豐富程度和均勻程度，在橫軸上的寬度代表物種豐富程度，曲線的形狀則表示物種的均勻程度，曲線平坦，表示樣品中腸道真菌微生物均勻度較高。如圖2可以看出，每條曲線對應一個樣品，用不同顏色標記。E組曲線最寬，C組最窄，各組曲線平坦程度相當。

2.1.2 日糧精粗比對真菌阿爾法多樣性的影響 Alpha多樣性分析可以反映測定樣品瘤胃微生物群落豐富度和多樣性，其中Chaol指數和ACE指數越大表明群落豐富度越大；Simpson指數越大反映群落多樣性越低；Shannon指數越大群落多樣性越高。由表2可知，E組Shannon指數顯著高于B、C組(P<0.05)；B、C組Simpson指數顯著高于其余各組(P<0.05)；B組ACE指數顯著高于其余各組(P<0.05)；Chaol指數中F組顯著高于其余各組(P<0.05)。

2.2 不同精粗比日糧對藏羊腸道真菌分布的影響

2.2.1 門水平下真菌分布分析 由表3可知，子囊菌門是各處理組的優勢菌門，占腸道真菌比例超過34%，且C、D和F組顯著高于A、B組(P<0.05)；擔子菌門是次優菌門，且B組顯著高于其余各組(P<0.05)；被孢霉菌門A、B組顯著高于其余處理組(P<0.05)；捕蟲霉亞門各組之間無顯著性差異(P>0.05)。

表2 阿爾法多樣性指數表

表3 門水平下真菌相對含量

2.2.2 科水平下腸道真菌菌群分布分析 由表4可知，被孢霉菌科為藏羊腸道真菌中優勢菌科，最高占比超過18%，且A、B組中占比較高(P<0.05)；絲孢酵母菌科C、D組顯著高于其余各組(P<0.05)；黏毛菌科則在低精料處理組(F和G組)中分布較廣(P<0.05)；酵母菌科則B組顯著高于其余各組(P<0.05)；G組中紅菇科相較其他處理組有較多分布(P<0.05)。

3 討 論

3.1 日糧精粗比對藏羊腸道真菌豐度的影響

許多學者研究表明，真菌在腸道所占比例較小，但對于腸道菌群穩態平衡至關重要[13]。腸道菌群通過影響某些營養素、激素和維生素的合成和代謝，通過清除藥物和有毒代謝物，為維持宿主健康作出了巨大貢獻；除此之外，真菌還可以通過促進宿主免疫系統中免疫細胞的發育和成熟來抵御病原體[14-15]。除此之外，腸道真菌同細菌關系緊密，它們穩定的拮抗、互利共生等關系是腸道微生物處于穩態平衡的根本。有學者運用ITS1序列，對以牛科、鹿科和長頸鹿科等為代表的反芻動物與袋鼠科、偽反芻動物駱駝科和河馬科前胃發酵非反芻動物，以及馬科、美洲鬣蜥科和犀科等后腸發酵動物(共29種)的糞便中厭氧真菌組成進行了系統比較，發現厭氧真菌的OTU數在4種發酵類型的動物糞便中無顯著差異，但在后腸發酵動物糞便中的厭氧真菌組成明顯有別于前胃發酵類型[16]。本試驗對藏羊飼以不同精粗比的日糧后發現，當精粗比為40∶60時，腸道真菌OTU數量最多，而其余處理組OUT數量差別不大，且真菌群落豐富度與多樣性與其他處理組相比均較好；試驗結果表明，對藏羊日糧中添加適量的粗飼料可以有效促進其腸道真菌定植與代謝。

3.2 日糧精粗比對藏羊腸道真菌物種分布的影響

通常認為，反芻動物消化道門水平下真菌具有解聚復雜分子結構的能力，例如降解木質纖維素生物量、提高動物飼料消化率、生產沼氣、生物乙醇和其他各種功能[17-19]。Avijit Dey等[20-21]給反芻動物直接飼喂厭氧真菌培養物發現，厭氧真菌可以提高其采食量、乳質量和乳產量等。近年來，許多學者利用真菌通用引物在反芻動物消化道內發現和報道了越來越多的非嚴格厭氧真菌，其中包括子囊菌門、擔子菌門和接合菌門等，瘤胃中子囊菌門相對豐度更高，可高達22.6%[22]。本研究結果發現子囊菌門、擔子菌門在藏羊腸道也廣泛存在，且豐度分別超過了34%和8%；除此之外被孢霉菌門的相對豐度在藏羊腸道中也不可忽視，豐度超過4%；說明日糧精粗比例并不會改變藏羊腸道優勢菌群種類，但對其豐度有較大影響。

表4 科水平下真菌相對含量

酵母菌是具有龐大的家族系統的兼性厭氧型真菌，種類達1000多種，是子囊菌門中的重要成員，其培養物作為一種安全環保的飼料添加劑，受到飼料生產者和研究者的重視；大量研究表明飼喂活酵母可促進瘤胃微生物數量和活力，改善產肉和產奶性能[23]。Williams PE等[24]研究表明,高精料日糧飼喂奶牛，活酵母可以加速瘤胃乳酸代謝，調控瘤胃pH值至穩定狀態；除此之外，飼喂活酵母可改善瘤胃的發酵特性，增強瘤胃微生物對纖維飼料的定殖，進而提高微生物對纖維飼料的降解能力[25]。寇慧娟[26]在研究酵母培養物對羔羊的影響發現，飼糧中添加20 g/kg酵母培養物可以顯著提高羔羊瘤胃內羧甲基纖維酶活性，同時促進羔羊瘤胃發育，也有利于維持瘤胃乳頭的正常形態，在高精料飼糧中效果更為明顯。李娜等[27]研究表明舍飼條件下灘羊羔羊瘤胃中釀酒酵母的含量高于放牧組羔羊，說明增加精料比例可以促進釀酒酵母在2月齡灘羊瘤胃內的定植。本試驗研究發現，當精粗比為70∶30時，酵母菌科相對豐度遠高于其他處理組，而其余處理組之間酵母菌科相對豐度無較大差距。

4 結 論

在本試驗條件下，藏羊腸道優勢菌群為子囊菌門和擔子菌門；當日糧精粗比例為40∶60時，藏羊腸道真菌微生物多樣性及豐富度較好；適量的精料可促進酵母菌科生長，精粗比在70∶30時酵母菌科相對豐度最高，但過高的精粗比例會抑制該菌生長。綜合上述結果，精粗比為40∶60時更適合藏羊腸道真菌定植及結構構建。