不同生長階段大口黑鱸腸道微生物多樣性研究

但 言，余鳳琴，李 雙，陳元坤，陳紅霖，李 燕，王恕橋

(重慶市水產科學研究所，重慶 401120)

【研究意義】腸道是魚類重要的消化和吸收器官[1]，腸道微生物存在于腸道壁、腸道黏膜及其內容物中[2]，是魚類腸道的重要組成部分，對魚類提供屏障、促進營養吸收、提高免疫具有重要作用[1]。魚類生長發育過程中腸道菌群結構會發生變化[3]。【前人研究進展】目前，腸道微生物的研究主要集中在不同環境[4-5]及疾病條件[6-7]下腸道微生物的差異、變化。【本研究切入點】采用高通量測序技術對大口黑鱸不同生長階段腸道微生物結構及多樣性進行分析?！緮M解決的關鍵問題】為大口鱸腸道微生態研究、鱸養殖技術改良、益生菌篩選、疾病預防提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及其養殖

實驗用魚為大口黑鱸(Micropterussalmoides)，養殖在重慶市水產科學研究所長壽湖基地池塘中。實驗用魚苗均為2019年孵出，當年4月份購入并放入池塘，其間每日投餌2次(8:30、16:00)，飼料為鱸魚專用商品飼料(粗蛋白≥50%，粗脂肪≥8%，粗灰分≤16%)，日投喂量為初始體重的3%～5%，并根據攝食情況隨時調整。

1.2 樣品采集

共采集有效樣品33個，第一次采集為5月齡(2019年8月，A組)，之后根據實際情況采集6月齡(2019年9月，B組)，7月齡(2019年10月，C組)，9月齡(2019年12月，D組)，10月齡(2020年1月，E組)，12月齡(2020年3月，F組)，14月齡(2020年5月，G組)，15月齡(2020年6月，H組)，16月齡(2020年7月，I組)，共采集9組，每次下午采集大口黑鱸腸道去除內容物置于5 mL凍存管中，置于-80 ℃的冰箱中保存待測。

1.3 DNA提取及16S rDNA高通量測序

樣品送至深圳微生太科技有限公司，根據E.Z.N.A.?soil試劑盒說明書進行總DNA抽提；用338F和806R引物對V4可變區進行PCR擴增，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit對回收PCR產物進行純化，洗脫后利用QuantiFluorTM-ST進行檢測定量。根據Illumina MiSeq平臺標準操作規程將純化后的擴增片段構建PE 2×300的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300平臺進行測序。

1.4 測序結果分析

對原始數據進行拼接、過濾，得到有效數據，基于有效數據進行OUTs聚類和物種分類分析，并將OUT和物種注釋結合，從而得到樣品的OTUs和分類譜系的基本分析結果。再對OTUs進行豐度及多樣性分析，同時將物種注釋在各個分類水平上進行群落結構的統計分析，并以LEfSe分析組間菌群差異。

2 結果與分析

2.1 不同生長階段大口黑鱸腸道微生物的α多樣性差異分析

各組大口黑鱸腸道微生物多樣性數據見表1，結果表明，5、6月齡OTU數量，Chao1指數，Shannon指數和Simpson指數均高于其他月齡，在6月齡(B組)均為最大，說明此階段大口黑鱸腸道微生物多樣性最高。

2.2 不同生長階段大口黑鱸腸道微生物種類組成差異分析

測得序列經過鑒定，在門水平上相對豐度大于2%的有9門。A組優勢菌群為厚壁菌門(Firmicutes，40.78%)，B～F組的優勢菌群為變形菌門(Proteobacteria)，G～I組的優勢菌群為梭桿菌門(Fusobacteria)。隨著養殖時間的推移，變形菌門在A～D組呈現出增加趨勢，隨后上下波動；梭桿菌門在A～D組呈現降低的趨勢，在E～H組升高，隨后降低；厚壁菌門在A～E組呈現降低的趨勢，隨后波動(表2)。

各生長階段大口黑鱸腸道微生物在屬水平上相對豐度大于2%的有17屬。其中A組的優勢種群為消化鏈球菌科(Peptostreptococcaceae，29.88%)，B、D組優勢種群為歐文氏菌屬(Erwinia，15.76%)，C、E組的優勢種群為支原體屬(Mycoplasma，35.24%)，D、E組優勢種群為假單胞菌屬(Pseudomonas)，G～I組優勢種群為鯨桿菌屬(Cetobacterium)。隨著時間推移，鯨桿菌屬占比呈先降低后升高再降低的趨勢，后期豐度大幅度提高；假單胞菌屬所占比例表現出A～E組升高后升高降低交替變化的趨勢。支原體在A～C組所占比例升高，D～E組降低，F～I組降低升高交替變化，鄰單胞菌屬(Plesiomonas)為G～I組腸道特有，拉恩氏菌屬(Rahnella)及肉食桿菌屬(Carnobacterium)為D～E組特有，歐文氏菌屬(Erwinia)在A和I組沒有分布(表3)。

表2 大口黑鱸腸道微生物樣品中主要門類所占比例

表3 大口黑鱸腸道微生物樣品中主要屬類所占比例

續表3Continued table 3

從屬水平物種表達譜熱圖(圖1,見封三)可以看出，大口黑鱸腸道微生物主要聚為兩大分支，多數B組和E、F、G、H、I組聚為一支，A組、C組及D組聚為一支，說明不同生長階段大口黑鱸腸道微生物組成差異明顯。鯨桿菌屬(Cetobacterium)、鄰單胞菌屬(Plesiomonas)和腐敗希瓦氏菌屬(Shewanella)在B、E、F、G、H、I組中的豐度明顯高于A、C、D組；而支原體屬(Mycoplasma)、假單胞菌屬(Pseudomonas)和歐文氏菌屬(Erwinia)則相反。

2.3 不同生長階段大口黑鱸腸道微生物的菌群豐度差異分析

通過LEfSe分析組間菌群差異，結果顯示(圖2,見封三)，A組標志微生物(與其他生長階段豐度差異顯著)為藍細菌門(Cyanobacteria)、棲熱菌門(Thermi)，B組標志微生物為披毛菌科(Gallionellaceae)，C組標志微生物為腸球菌科(Enterococcaceae)，D組標志微生物為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，E組標志微生物為假單胞細菌科(Pseudomonadaceae)，H組標志微生物為梭桿菌門(Fusobacteria)。

3 討 論

3.1 不同生長階段大口黑鱸腸道菌群多樣性比較

本研究對大口黑鱸9個生長階段共33個樣品的腸道細菌16S rRNA進行了高通量測序，通過α多樣性分析，5、6月齡OTU數量，Chao1指數，Shannon指數和Simpson指數均高于其他月齡，在6月齡(B組)均為最大。佟延南等利用同樣方法對海南省多個養殖場羅非魚腸道微生物進行多樣性研究，結果顯示微生物多樣性養殖中期>養殖后期>養殖前期[8]，這與本研究結果存在相似點。不同地域、不同魚類腸道微生物多樣性均在養殖中期出現峰值，反映出可能與魚類生長發育有較大的相關性。對斑點叉尾鮰[9]和斑馬魚[10]的研究結果也指出，魚類生長發育過程中腸道微生物類群不斷變化，而且這種變化與水環境和飼料改變沒有必然聯系。

3.2 門和屬水平上不同生長階段大口黑鱸腸道菌群結構比較

在門水平上的分析結果顯示，變形菌門、厚壁菌門和梭桿菌門是大口黑鱸腸道的優勢菌，在15月齡(H組)二者所占比例之和達到93%以上。雷陽等對雙斑東方鲀腸道菌群進行高通量測序分析，發現其腸道菌群主要為變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和梭桿菌門，其中變形菌門為野生雙斑東方鲀和養殖雙斑東方鲀腸道菌群的優勢菌，梭桿菌門在野生雙斑東方鲀腸道中占有很大比例[11]。蘇月華等研究表明白甲魚腸道細菌以梭桿菌門、變形菌門、螺旋菌門、厚壁菌門和軟壁菌門為主，其中梭桿菌門占比達到70%以上[12]。Wu等用高通量測序方法對草魚、黃顙魚腸道菌群進行研究，發現其主要為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門[13-14]。以上研究表明，變形菌門、厚壁菌門和梭桿菌門是大多數魚類腸道微生物的主要菌群。變形菌門是細菌中較大的一個門類，廣泛分布于環境和動植物體內[15-19]，門內種類繁多，在哺乳動物中變形菌門被視為腸道菌群失調的微生物標志，研究中變形菌門一直為菌群優勢種類，而對其他肉食性魚類如虹鱒[20]、鱖[21]的研究也表明，變形菌門豐度占絕對優勢地位。由此可見變形菌門對宿主的作用機制復雜，尤其對魚類作用機制還需要進一步研究。厚壁菌門比例上升在哺乳動物中提示為肥胖病，與糖尿病密切相關，而厚壁菌門卻為魚類腸道菌群主要成員；Semova等對無菌斑馬魚的研究表明，腸道菌群可以促進腸上皮及肝組織中的脂肪的吸收并促進脂滴的形成，其中厚壁菌門起到了關鍵作用[22]。本研究表明大口黑鱸生長過程中厚壁菌門比例逐步下降，可能提示魚類養殖后期面對脂肪沉積、糖尿病方面的疾病壓力更小。梭桿菌門是一類兼性厭氧微生物，能夠發酵多糖和蛋白質產生以乙醇和短鏈脂肪酸，其中短鏈脂肪酸是魚腸道中重要的有機酸，腸道內壁細胞基本的代謝能量來源于此，本研究中梭桿菌門在生長后期占比明顯增高。

屬水平上的分析結果顯示，鯨桿菌屬、假單胞菌屬、支原體屬所占比例較大，其中鯨桿菌屬在15月齡所占比例達到90.21%。張婧怡等[5]、Tsuchiya等[23]和Kessel等[24]研究表明，羅非魚不同環境不同階段腸道鯨桿菌屬豐度均較高。胡俊在對魚類腸道粘附菌群探究中認為鯨桿菌屬具有更好的定植能力[25]。此外，鯨桿菌屬能夠發酵多肽碳水化合物，產生維生素B12，研究中在梭桿菌門中占絕對優勢地位，在養殖后期鯨桿菌顯著增多。以上研究表明，鯨桿菌屬是魚類腸道菌群的重要組成部分，豐度可能與魚類發育相關。假單胞菌屬為一種條件病原體，在環境良好的情況下，可產生多種抗生素和活性小分子物質，具有抗菌溶菌作用，而在惡劣的環境下會使魚體表面潰爛，體內腫脹充血等[26]。沈錦玉等從浙江寧波、臺州網箱養殖死亡大黃魚體內分離和鑒定出致病力極強的惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)[27]，劉年鋒等對福州地區內臟出現白點的網箱養殖大黃魚進行研究，分離鑒定出優勢致病菌變形假單胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)[28]。以上研究表明，假單胞菌屬易對宿主產生脅迫作用，需要關注。支原體屬廣泛存在于動物體內，研究中7月齡(C組)相對豐度為35.24%。Holben等研究表明，支原體屬在養殖大馬哈魚(Salmosalar)腸道中的相對豐度分別為25%、81%，在野生大馬哈魚中的相對豐度為96%[29]；Li等對揚子江上游圓口銅魚(Coreiusguichenoti)的腸道菌群進行研究，發現雌性魚以支原體屬為主[30]。以上研究表明，支原體屬在魚類腸道中廣泛存在。

4 結 論

不同生長階段的大口黑鱸腸道微生物群落結構差異明顯；多樣性在養殖前期較高；厚壁菌門在生長過程中逐步減少；梭桿菌門在生長過程中逐步增加，其中鯨桿菌屬起絕對作用。在養殖大口黑鱸的過程中，應注意結合生長發育情況，注意腸道微生物菌群調控，提高養殖和疾病防治水平。