染色體結構維持蛋白Smc5/6復合體的結構與功能*

廖桂艷，金 城,2，汪 斌**

(1.廣西科學院,生物科學與技術研究中心，廣西南寧 530007； 2.中國科學院微生物研究所，北京 100101)

0 引言

染色體攜帶了生物體的遺傳信息，并在細胞中代代相傳，保證了各個物種的遺傳穩(wěn)定性。在細胞的分裂過程中染色體必須被正確地拷貝和精確地分配，同時修復存在的DNA損傷，確保新的細胞中含有與親代細胞相同的遺傳信息。在人體的1×1014個細胞中每天都發(fā)生數(shù)千個DNA損傷，這些損傷可能源于代謝副產(chǎn)品活性氧族引起的損傷或DNA復制過程中的失誤，也可能源于紫外線(UV)照射、電離輻射(Ionizing Radiation,IR)或化學物質等外界因素[1]。這些DNA損傷都有導致基因突變的潛在可能，而未修復的基因突變可能通過RNA和蛋白質表達影響細胞的功能，并遺傳給子代細胞，引起細胞衰老、凋亡和癌變等。 DNA損傷修復機制已成為遺傳學領域研究的熱點。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，染色體結構維持蛋白(Structure Maintenance of Chromosome,Smc)在維持染色體結構及DNA損傷修復方面發(fā)揮關鍵作用。Smc蛋白家族包括3類：黏連蛋白(Cohesin)，凝縮蛋白(Condesin)和Smc5/6復合體(Smc5/6 complex)。黏連蛋白主要在細胞分裂前期發(fā)揮作用，將新復制的兩條姐妹染色單體聚集在一起，促進姐妹染色單體的重組；凝縮蛋白主要參與細胞分裂中期染色體的凝縮過程；Smc5/6復合體在細胞周期的調控、有絲分裂和減數(shù)分裂的DNA損傷修復、維持基因組的穩(wěn)定性方面都具有重要的調控作用[2-4]。目前對黏連蛋白和凝縮蛋白的功能研究比較深入，而對Smc5/6復合體的功能和分子機理研究相對較少。因此，深入研究Smc5/6復合體的結構和各亞基的功能，對進一步理解DNA損傷修復機制及基因組穩(wěn)定性的分子機制具有重要的指導意義。本文綜述了近年來對Smc5/6復合體的研究進展，從Smc5/6復合體的結構特征和生物學功能兩個方面進行闡述。

1 Smc5/6復合體的結構特征

1.1 Smc5/6復合體的組件蛋白

Smc5/6復合體首次被發(fā)現(xiàn)是在裂殖酵母中鑒定到的具有Smc蛋白結構的Rad18和Spr18的異質二聚體[5]。Smc5/6蛋白復合體由兩個Smc蛋白(Smc5和Smc6)異二聚體及非Smc蛋白亞基共同組成，其中在酵母、擬南芥和人體細胞中已有6個非Smc亞基(Nse1-6)被鑒定出來[6-9]。Smc蛋白是由1 000-1 300個氨基酸殘基組成的多肽，在N-端和C-端分別有一個球狀的結構域，而在Smc蛋白中間含有一個鉸鏈(Hinge)結構域。N-端和C-端的球狀結構域由中間的鉸鏈結構域以反向平行的相互作用方式聚集在一起，產(chǎn)生一個具有ATP酶活性的球狀頭部(Heads)結構域[10,11]。Smc5和Smc6蛋白在不同物種之間相對保守，具有相似的Smc蛋白結構特征。由于Nse1的C-端含有一個Ring-like結構域，因此推測Nse1可能具有泛素化蛋白酶的特性。研究發(fā)現(xiàn)Nse1單獨作用時并不具有泛素化蛋白酶活性，但有Nse3同時存在時表現(xiàn)出微弱的泛素化蛋白酶活性[12]。Nse2/Mms21最初在出芽酵母中通過遺傳篩選鑒定得到[13]，Nse2/Mms21的C-端也包含一個Ring 結構域，賦予了Nse2/Mms21的SUMO連接酶活性[14,15]。Nse3的C端含有一個mage功能域，研究發(fā)現(xiàn)該結構域具有DNA結合特性，nse3基因在真菌及植物中是單拷貝，但是在人體細胞中與具有多拷貝的黑色素瘤抗原基因(mage)有很高的相似度，研究發(fā)現(xiàn)人體細胞中只有Mage-G1蛋白能與Smc5/6復合體發(fā)生免疫共沉淀[16-18]。Nse4是具有螺旋翼狀域的結構蛋白，是Smc5/6復合體的必需蛋白，作為橋梁結合到Smc蛋白上穩(wěn)定復合體的結構，在維持整個復合體的穩(wěn)定性方面發(fā)揮關鍵作用[19]。Nse5和 Nse6蛋白是Smc5/6復合體的非保守部分，目前僅在酵母、擬南芥和人體細胞鑒定到。

1.2 Smc5/6復合體的結構特征

整個Smc5/6蛋白復合體由3個亞復合體(Smc5-Smc6-Nse2、Nse1-Nse3-Nse4、Nse5-Nse6)按照特定的形式組合而成[19-21](圖1)。Smc5-Smc6-Nse2亞復合體是整個Smc5/6復合體的核心組件，構成了整個復合體的支架。Smc5和Smc6兩個蛋白通過其鉸鏈結構域相互作用形成異二聚體(Smc5-Smc6)，Nse2/Mms21通過其N-末端與Smc5的卷曲螺旋結構域結合形成Smc5-Smc6-Nse2亞復合體[14,22]。Nse1、Nse3和Nse4形成的Nse1-Nse3-Nse4亞復合體具有高度的保守性，結合在Smc5和Smc6的球狀頭部結構域和DNA分子，該三聚體的穩(wěn)定性對于Smc5/6復合體在指定的DNA損傷位點聚集是必需的。Nse1通過Ring-like 結構域與Nse3的N-端相互作用增加其對雙鏈DNA的結合作用[23]。Nse3的C-端與Nse4直接相互作用進一步形成異源三聚體Nse1-Nse3-Nse4[24]。Nse4一方面與Nse3結合形成Nse1-Nse3-Nse4異源三聚體，另一方面與Smc5和Smc6的頭部相結合使得Smc5/6復合體形成一個封閉的環(huán)狀結構[19]。Nse5-Nse6二聚體在不同的生物體中具有較大差異。Nse5和Nse6在裂殖酵母中以二聚體的形式結合在Smc5/6復合物的球形頭部區(qū)域附近，在芽殖酵母中Nse5和Nse6與Smc5/6的鉸鏈區(qū)相互作用，而在擬南芥和人體細胞中這兩個蛋白的定位還未知[8,20,25]。近期Taschner等[26]研究發(fā)現(xiàn)，在芽殖酵母中Nse5-Nse6二聚體具有頭部和鉸鏈區(qū)兩個結合位點，通過抑制Smc5/6復合體的ATP水解酶活性，對Smc5/6復合體結合DNA底物具有重要的調控作用。

2 Smc5/6復合體的生物學功能研究

對Smc5/6復合體的生物學功能研究相對較少，近年來在真菌、動物和植物等模式生物中的研究發(fā)現(xiàn)，Smc5/6復合體在DNA損傷修復、緩解復制壓力、維持端粒長度、維持細胞的正常分裂和分化等方面具有重要作用[27]。

Smc5/6由Smc5、Smc6和非Smc亞基構成，其中Nse1、Nse2 (Mms21)、Nse3 (Mage-G1)和Nse4 4個亞基在真核生物中高度保守，而Nse5和Nse6在序列上不保守，目前僅在酵母、擬南芥和人體細胞中被發(fā)現(xiàn)

2.1 參與DNA損傷修復

細胞由于外界環(huán)境或自身因素的影響會導致各種DNA損傷，其中DNA雙鏈斷裂(Double Stand Break,DSB)是一種嚴重的DNA損傷，機體中未能修復的DSB將嚴重影響個體的生長和發(fā)育。在細胞中主要存在兩種DSB修復途徑：非同源重組末端連接(Non-Homologous End Joining,NHEJ)和同源重組修復(Homologous Recombination,HR)。NHEJ主要在細胞有絲分裂G1期發(fā)揮作用，直接對斷裂部位通過末端連接的方式完成DSB的修復。HR主要發(fā)生在細胞有絲分裂G2/S期，利用染色體為模板以同源重組的方式完成DSB的修復，這是細胞中最精確的DNA修復途徑。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Smc5/6復合體在DNA同源重組修復方面發(fā)揮重要作用，在裂殖酵母S.pombe中nse1基因缺失導致對由電離輻射(IR)、紫外線(UV)和甲基磺酸甲酯(MMS)引起的DNA損傷修復缺陷[12,28]，裂殖酵母中Smc5/6能與同源重組關鍵蛋白Rad51/Rhp51相互作用，表明Smc5/6在同源重組修復中具有重要的作用[8,29]。在釀酒酵母S.cerevisiae有絲分裂G2期，Smc5/6通過影響Rad50/Mre11聚集在DSB損傷位點來影響姐妹染色單體重組完成DSB的修復[30,31]。在出芽酵母中，Smc5/6蛋白復合體能直接與RecQ解螺旋酶Sgs1結合，進而引導Sgs1定位于DNA損傷位點，形成STR復合體(Sgs1-Top3-Rmi1)，該復合體在DSB同源重組修復中起著關鍵的調控作用[32,33]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Smc5/6復合體不僅在真菌中，而且在動物和植物細胞中也參與DSB的同源重組修復[30,34-37]。在人體細胞中，Nse2通過Smc6和DNA修復蛋白TRAX的類泛素化促進DNA同源重組修復功能[14]。此外，Nse2通過介導Smc5蛋白的泛素化作用，在DNA損傷修復、DNA復制和維持基因組穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用[38,39]。在非洲爪蟾卵細胞中鑒定得到兩個新的蛋白因子Slf1和Slf2，與Rad18蛋白形成Rad18-Slf1-Slf-2三聚體復合物，招募Smc5/6復合體到DNA損傷位點降低基因組的不穩(wěn)定性[40]。在擬南芥中，Nse1、Nse3和Nse4蛋白功能的缺失導致嚴重的DNA損傷修復缺陷[41-43]。雖然在人體和酵母細胞中Nse1沒有檢測到泛素化酶活性，但Nse1對于DNA損傷修復、染色體復制及穩(wěn)定性是必需的[12]。

2.2 緩解DNA復制壓力

細胞內DNA復制不僅受到細胞代謝產(chǎn)物的影響，而且由于DNA復制過程中超螺旋結構的積累和姐妹染色體纏繞(SCIs)形成的拓撲壓力會導致DNA復制無法順利進行，只有去除DNA超螺旋結構和染色體纏繞才能使得DNA復制順利進行[44]。研究發(fā)現(xiàn)Smc5/6復合體在去除DNA超螺旋結構的積累及姐妹染色體纏繞形成的拓撲壓力過程中發(fā)揮重要作用，通過去除復制過程產(chǎn)生的有害中間體或者重新啟動受阻的復制叉進而保證DNA復制順利進行[27,45]。通過對Smc5/6復合體的定位和表型分析，發(fā)現(xiàn)Smc5/6復合體參與DNA的復制過程：在釀酒酵母有絲分裂S期，Smc5/6存在于染色體的復制初始位點，而在G2/M期其分布方式類似于黏連蛋白的分布方式，Smc5/6存在方式的改變表明其與復制叉有關系并跟隨復制叉一起前行[31,46]。釀酒酵母中拓撲異構酶Top1和Top2協(xié)同作用去除DNA的超螺旋結構及SCIs[46]，而在人體細胞中Smc5/6復合體功能的缺失導致拓撲異構酶Top2異常分布，從而進一步導致超螺旋結構、SCIs積累及染色體的異常分離[47],這一結果表明Smc5/6復合體通過影響拓撲異構酶的分布進一步參與DNA的超螺旋結構及SCIs的去除。此外，Smc5/6復合體在降解由DNA復制引起的有害重組中間體以及重新啟動復制叉的前行中也具有重要作用[48]。在DNA復制的模板置換過程中，DNA的模板鏈和合成鏈發(fā)生相互交連形成“X”型的HJ中間體，從而導致DNA復制無法正常進行。釀酒酵母中Smc5/6復合體定位分析發(fā)現(xiàn)其存在于終止的復制叉位點，且在Smc5/6突變體中發(fā)現(xiàn)“X”型重組中間體的積累，表明Smc5/6復合體可能與重組中間體的修復相關[32]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，酵母中RecQ型解旋酶(Sgs1)通過與多聚SUMO鏈和Smc5/6復合體的SUMO E3復合體相互作用，利用泛素化途徑降解同源重組形成的中間體[32,33]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Nse5和Nse6蛋白在減數(shù)分裂的DNA重組中間體的清除和緩解復制壓力方面具有重要作用[49,50]。在裂殖酵母中Smc5/6復合體的SUMO連接酶活性及其與染色體的結合依賴于Nse5-Nse6二聚體，而且Brc1與Nse5-Nse6二聚體發(fā)生相互作用，引導Smc5/6復合體定位于DNA復制叉位點，促進Smc5/6復合體對DNA復制過程產(chǎn)生的錯誤復制叉的清除[51]。

2.3 維持端粒長度

Smc5/6復合體在維持端粒長度方面的研究相對較少，只在酵母細胞及人體細胞中有少量報道[52-54]。研究發(fā)現(xiàn)Smc5/6復合體存在于染色體的末端[55]。在酵母細胞中，組成Smc5/6復合體的Nse2、Smc5和Smc6蛋白功能的缺失會導致端粒的縮短以及衰老[52]。在端粒酶陽性細胞中，smc6-9基因缺失在染色體終端表現(xiàn)出由于同源重組缺陷引起的重復序列錯誤分離。另外，mms21-11基因缺失表現(xiàn)出端粒聚集缺陷進而增加端粒位置效應(TPE)[15,52,53]。在端粒酶陰性細胞中，smc6-9和mms21-11等位基因突變加速了由于重組中間體積累引起的細胞衰老及DNA復制提前終止[55]。Sir4是端粒位置效應的一個重要調節(jié)因子，研究發(fā)現(xiàn)Smc5/6復合體能與Sir4發(fā)生相互作用，對端粒位置效應有重要影響[56]。

where Km(x) is the modified Bessel function, and Im(x) is the modified Hankel function, , , and b is the propagation constant. Similarly, the eigenvalue equation of the HEmnmode can also be derived (Supplementary information Section 1).

2.4 維持細胞正常分裂

細胞的正常分裂是生物體生長發(fā)育的基礎，研究發(fā)現(xiàn)Smc5/6復合體對細胞的正常分裂具有重要作用。在模式植物擬南芥中，Nse2通過對細胞周期及細胞分裂素信號通道的調控來維持根部細胞的正常分裂[57]。Nse1和Nse3蛋白功能的缺失導致嚴重的細胞分裂異常，進而影響植株胚胎的發(fā)育及種子的形成[41]。Nse3在有絲分裂染色體的正常分離過程中也發(fā)揮重要作用[7]。在模式植物擬南芥中發(fā)現(xiàn)兩個功能保守的Nse4同源蛋白(Nse4A和Nse4B)，nse4突變株在減數(shù)分裂染色體分離、植株生長和種子形成方面存在嚴重缺陷，表明Nse4蛋白在維持正常的減數(shù)分裂、植株的生長和種子形成過程中具有重要作用[42,43]。在擬南芥植株中同時敲除smc6a和smc6b基因將嚴重影響植株配子和種子的形成[58]。通過擬南芥自然變異植株，鑒定得到Smc5/6復合體亞蛋白Sni1，其對細胞減數(shù)分裂交叉點分布具有調控作用，揭示Smc5/6復合體在植物減數(shù)分裂同源重組中具有重要的功能[59]。

2.5 其他功能

近期研究表明，Smc5/6復合體不僅在DNA損傷修復、DNA復制、維持端粒長度和正常細胞分裂等方面發(fā)揮重要作用，而且在維持核糖體功能、細胞凋亡調控及抑制病毒增殖等方面也發(fā)揮重要作用。在釀酒酵母中，Nse2(Mms21)功能的缺失導致核糖體RNA產(chǎn)量減少和核糖體蛋白在細胞核中的積累，表明Nse2對維持細胞核的正常功能也具有重要作用[60]。近期在玉米中對Nse2同源蛋白(MMS21)的SUMO化進行了研究，發(fā)現(xiàn)其通過影響染色質結構進而影響基因的轉錄調控，導致種子致死、花粉和種子萌發(fā)嚴重受損[61]。在網(wǎng)柄菌Dictyosteliumdiscoideum中，通過RNA干擾降低Nse4蛋白的表達，增加了紫外照射引起的細胞凋亡和由饑餓誘導形成的子實體的數(shù)目[62]。此外，Smc5/6復合體作為病毒抑制子在控制病毒增殖方面具有重要作用[63，64]。

3 總結

本文從Smc5/6復合體的結構特征和生物學功能兩個方面對近年來Smc5/6復合體的研究進展進行了闡述。Smc5/6復合體在DSB同源重組修復、消除DNA復制壓力、去除有害的復制中間體及維持端粒的長度等方面發(fā)揮重要作用。此外，Smc5/6復合體在胚胎發(fā)育、維持核糖體功能和抑制病毒增殖等方面也有相關報道，但其作用機制尚不清楚[34]。關于Smc5/6復合體的結構和功能在酵母細胞中的報道相對較多，在植物中的報道較少，而在整體動物模型水平上幾乎沒有報道。對Smc5/6各亞基的功能研究較少，特別是Nse1、Nse3、Nse4、Nse5、Nse6蛋白亞基的分子作用機制在很大程度上是未知的。因此，關于Smc5/6復合體和各亞基在植物和整體動物模型中的功能與分子作用機理還有待進一步探索。