厚藤提取物對(duì)膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型大鼠的治療作用研究*

韋棪婷，郝二偉，夏中尚,3，蔣秋燕，杜正彩，鄧家剛，侯小濤**

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧 530200；3.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川成都 611137)

0 引言

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一種慢性、系統(tǒng)性、自身免疫性炎癥疾病，主要攻擊滑膜關(guān)節(jié)，進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞、關(guān)節(jié)畸形和功能喪失等障礙疾病，這是造成勞動(dòng)力喪失和殘疾的主要原因，嚴(yán)重危害人類健康[1,2]。在我國，RA總患病率為0.32%-0.36%[3]。目前臨床上常用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的藥物為非甾體抗炎、甾體激素等[4]，均存在諸多不良反應(yīng)。RA在中醫(yī)屬“痹證”范疇，其病由人體正氣不足、臟腑功能失調(diào)、風(fēng)濕寒熱燥等外邪入侵，痰瘀氣滯，氣血運(yùn)行不暢所引起[5]。中醫(yī)藥具有療效好、依賴性低、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，利用其治療RA疾病已成為研究熱點(diǎn)[6]。

厚藤(Ipomoeapes-caprae)為旋花科(Convolvulaceae)番薯屬(Ipomoea)植物，是我國常用海洋中藥材，具有祛風(fēng)除濕、消癰散結(jié)、拔毒消腫的功效，在民間應(yīng)用廣泛。現(xiàn)代藥理研究報(bào)道，厚藤具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等功效[7]。目前，厚藤抗RA作用的研究報(bào)道較少，本文探討厚藤提取物(Ipomoeapes-capraeExtract,IPE)對(duì)Ⅱ型膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎(Collagen-induced Arthritis,CIA)模型大鼠的治療作用，為臨床應(yīng)用及產(chǎn)品開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，6周齡，體質(zhì)量160-200 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK (湘) 2019-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于溫度(23±2)℃、濕度50%-60%、12 h/12 h晝夜交替光照的環(huán)境中，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)DW20190418-015)。

1.1.2 藥材

厚藤采自廣西防城港市北侖河口國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定為旋花科植物厚藤(Ipomoeapes-caprae(L.)Sweet)的全草。

1.1.3 藥品及試劑

牛Ⅱ型膠原(CⅡ,美國Chondrex，批號(hào)：190578)，弗氏不完全佐劑(IFA,美國Chondrex，批號(hào)：190572)，弗氏完全佐劑(CFA,美國Chondrex，批號(hào)：190447)，雷公藤多苷(江蘇美通制藥公司，批號(hào)：200401)，PGE2 ELISA Kit (Bioswamp生物科技有限公司，批號(hào)：RA20013)，RF ELISA Kit (上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ml525301)，CRP ELISA Kit (上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號(hào)：ml038253)。

1.1.4 儀器

CPA225D萬分之一天平(德國賽多利斯科學(xué)儀器北京公司)，HDM-500型恒溫電熱套(江蘇天由發(fā)展有限公司)，Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司)，TGL-16M型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)，M200PRO型酶標(biāo)儀[帝肯(上海)貿(mào)易有限公司]。

1.2 方法

1.2.1 厚藤提取物的制備

稱取厚藤全草2.5 kg，切成約10 cm粗段，加水提取2次，第1次加12倍量水，第2次加10倍量水，煮沸后再煎30 min，用200目紗布過濾，合并藥液，55℃減壓濃縮至稠膏，取提取物稠膏，稀釋至相應(yīng)灌胃濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 動(dòng)物分組、模型復(fù)制及給藥

60只大鼠經(jīng)適應(yīng)性喂養(yǎng)5 d后，按體質(zhì)量隨機(jī)選取8只作為空白組，其余52只大鼠用于復(fù)制模型。造模時(shí)，將牛Ⅱ型膠原(CⅡ)溶液與等體積弗氏完全佐劑(CFA)混合乳化后，除空白組外，其余組大鼠取背部脊柱兩側(cè)和尾根部皮內(nèi)注射配置好的膠原乳劑0.1 mL，共0.3 mL。初次免疫第7 d，將CⅡ溶液與等體積弗氏不完全佐劑(IFA)混合乳化后，在大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)皮下注射0.1 mL進(jìn)行第2次免疫?？瞻讓?duì)照組于相同部位注射等量生理鹽水。造模24 d后，挑選造模成功(關(guān)節(jié)炎指數(shù)AI≥3)的大鼠，根據(jù)炎癥指數(shù)隨機(jī)分為5組，即模型組，陽性組，厚藤提取物高、中、低劑量組，每組8只。

厚藤提取物高、中、低劑量組分別按2.271 2，1.135 6，0.567 8 g/kg鼠重(分別相當(dāng)于人每日服生藥材120，60，30 g)灌胃，陽性對(duì)照組按9 mg/kg鼠重給予雷公藤多苷混懸液(加蒸餾水配制成0.6 mg/mL雷公藤多苷混懸液)灌胃，空白組和模型對(duì)照組給予等體積的純化水，每次灌胃容量按1.5 mL/100 g鼠重給予。每日1次，連續(xù)21 d。

1.2.3 大鼠情況觀察

自給藥起，每日觀察并記錄大鼠活動(dòng)情況、精神狀況、皮毛光澤度、大小便等變化。

1.2.4 踝關(guān)節(jié)腫脹度測定

造模前，在每只大鼠踝關(guān)節(jié)測量處用馬克筆進(jìn)行畫線標(biāo)記，確保每次測量位置一致。經(jīng)2次免疫后，每3 d采用2-3 mm寬紙條和透明軟尺，固定測量大鼠右后足踝關(guān)節(jié)0.5 mm處的關(guān)節(jié)周徑。踝關(guān)節(jié)腫脹度=(致炎后關(guān)節(jié)周徑-致炎前初始周徑)/致炎前初始周徑。

1.2.5 足跖腫脹度測定

大鼠經(jīng)2次免疫后，每3 d用數(shù)顯游標(biāo)卡尺測量大鼠右后足跖厚度，足趾腫脹度=(致炎后足跖厚度-致炎前足跖厚度)/致炎前足跖厚度。

1.2.6 關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)評(píng)價(jià)

根據(jù)關(guān)節(jié)炎癥評(píng)分與計(jì)數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)[8](表1)，對(duì)大鼠進(jìn)行關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分(總分為四足評(píng)分之和)。

表1 關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.7 血清中PGE2、RF、CRP含量測定

末次給藥后，大鼠禁食不禁水12 h。采集血液標(biāo)本前，用10%水合氯醛按0.3 mL/100 g鼠重腹腔注射使各組大鼠麻醉，腹主動(dòng)脈取血，室溫放置2 h，3 000 r/min離心10 min，吸出血清，于-80℃低溫冰箱保存待測。采用ELISA試劑盒按照說明書檢測各組大鼠血清中前列腺素E2(Prostaglandin E2,PGE2)、類風(fēng)濕因子(Rheumatoid Factor,RF)、C-反應(yīng)蛋白(C-reaction Protein,CRP)表達(dá)情況。

1.2.8 滑膜組織病理分析

腹主動(dòng)脈取血后，截取大鼠的踝關(guān)節(jié)，剔除表面皮膚和肌肉，置于4%多聚甲醛溶液中固定3 d后，換入新的固定液繼續(xù)固定4 d，將踝關(guān)節(jié)用PBS清洗3次，繼而用純化水清洗3次，將踝關(guān)節(jié)轉(zhuǎn)移至20倍體積的脫鈣液中脫鈣，脫鈣液每周更換1次，4-6周時(shí)用針刺、鉗夾的方法檢查脫鈣情況，待針刺無阻力感時(shí)終止脫鈣，將組織脫水、石蠟包埋、切片，經(jīng)切片脫蠟后進(jìn)行HE染色。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 大鼠后肢腫脹情況觀察

大鼠后肢踝關(guān)節(jié)腫脹情況如圖1所示?？瞻捉M(圖1a)大鼠活動(dòng)自如，無關(guān)節(jié)炎癥現(xiàn)象，毛發(fā)順滑光亮，飲食、大小便正常。模型組(圖1b)大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹嚴(yán)重，以右后足踝關(guān)節(jié)腫脹最為明顯，行動(dòng)遲緩，毛發(fā)枯萎且色澤暗淡，精神逐漸萎靡，進(jìn)食減少。給予厚藤提取物干預(yù)后，大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度得到減輕。

圖1 各組大鼠后肢腫脹情況

2.2 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響

由表2可知，各組造模大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度與空白組相比均顯著提高(P<0.01)。各治療組與模型組相比均無顯著性差異(P>0.05)，其中，厚藤提取物高劑量組有減輕踝關(guān)節(jié)腫脹度的趨勢。厚藤提取物高、中、低劑量組與陽性組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度的影響

2.3 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠足跖腫脹度的影響

厚藤提取物對(duì)CIA大鼠足跖腫脹度的影響結(jié)果如表3所示。與空白組相比，各組造模大鼠足跖腫脹度均顯著提高(P<0.01)。與模型組相比，厚藤提取物各治療組在給藥18 d后，隨著給藥濃度的升高，足跖腫脹度有逐漸下降的趨勢，但各組間無顯著性差異(P>0.05)。厚藤提取物各組與陽性組比較，均無顯著性差異(P>0.05)。

表3 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠足跖腫脹度的影響

2.4 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)的影響

由圖2可知，與空白組相比，各組造模大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，陽性組、厚藤提取物高劑量組在給藥15 d后關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)降低(P<0.05)，厚藤提取物中劑量組在給藥18 d后關(guān)節(jié)炎癥指數(shù)降低(P<0.05)。與陽性組相比，厚藤提取物各治療組均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

與空白組比較##P<0.01；與模型組比較*P<0.05

2.5 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠血清中PGE2、RF、CRP表達(dá)的影響

由表4可知，模型組大鼠與空白組相比，血清中PGE2、RF、CRP水平均顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，各給藥組能顯著降低RF水平(P<0.01)；除厚藤提取物低劑量組外，厚藤提取物高、中劑量組能顯著降低PGE2、CRP水平(P<0.05，P<0.01)。與陽性組相比，厚藤提取物低劑量組血清中PGE2含量明顯升高(P<0.05)，厚藤提取物各組RF含量均顯著升高(P<0.01)，而CRP含量無顯著性差異(P>0.05)。

表4 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠血清中PGE2、RF、CRP表達(dá)的影響

2.6 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠滑膜組織病理變化的影響

大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片結(jié)果如圖3所示。光學(xué)顯微鏡下，空白組踝關(guān)節(jié)組織軟骨結(jié)構(gòu)完整，骨層清晰，關(guān)節(jié)面光滑，軟骨細(xì)胞分布均勻，軟骨內(nèi)無血管和神經(jīng)，骨小梁較寬，骨髓腔中細(xì)胞分布密集、無空曠區(qū)；滑膜結(jié)構(gòu)清晰完整，襯里層由單層或雙層滑膜細(xì)胞組成，排列疏松且部分不連續(xù)，滑膜組織無炎性細(xì)胞浸潤及纖維組織增生。模型組軟骨和軟骨下層骨組織受侵蝕，見局部軟骨細(xì)胞嚴(yán)重減少，部分軟骨細(xì)胞壞死，見軟骨細(xì)胞著色較深，胞質(zhì)溶解，排列紊亂，軟骨層及軟骨下層骨組織形成纖維裂隙，裂隙間大量毛細(xì)血管增生形成血管翳，較多炎性細(xì)胞浸潤，見核呈圓形深染的淋巴細(xì)胞和核呈桿狀或分葉狀的中性粒細(xì)胞，骨組織中見大量的纖維組織填充，可見核呈長橢圓形的成纖維細(xì)胞增生。與模型組相比，厚藤提取物低劑量組踝關(guān)節(jié)組織病變程度相差不大，厚藤提取物中劑量組踝關(guān)節(jié)組織病變程度相對(duì)有所減輕，陽性組和厚藤提取物高劑量組踝關(guān)節(jié)組織病變程度得到明顯減輕。

圖3 厚藤提取物對(duì)CIA大鼠踝關(guān)節(jié)病理切片的影響

3 討論

厚藤作為一種常用海洋中藥，現(xiàn)代研究表明，厚藤中含有樹脂糖苷類、黃酮類、酚酸類等成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種藥理活性[7]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，厚藤水提物具有抗急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎(Acute Gouty Arthris,AGA)作用[9]，AGA與RA都屬于風(fēng)濕病，歸屬于中醫(yī)“痹證、痹病”等范疇，本研究旨在探討厚藤提取物對(duì)CIA大鼠的治療作用。

CIA大鼠關(guān)節(jié)腫脹和炎癥指數(shù)評(píng)價(jià)是反映病程的主要指標(biāo)，進(jìn)而評(píng)定藥物的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與模型組相比，厚藤提取物各治療組的踝關(guān)節(jié)腫脹度、足跖腫脹度有減輕的趨勢但無顯著性差異(P>0.05)，厚藤提取物高、中劑量組可降低CIA大鼠關(guān)節(jié)炎癥評(píng)分指數(shù)。在實(shí)驗(yàn)過程中，造模大鼠發(fā)病時(shí)間、病情程度不一。首次免疫時(shí)將CⅡ和CFA混合乳化后，在大鼠背部兩側(cè)及尾根部3點(diǎn)皮內(nèi)注射，造成大鼠后期出現(xiàn)不同腫脹情況，部分大鼠兩后足均出現(xiàn)腫脹現(xiàn)象，個(gè)別大鼠出現(xiàn)前肢腫脹；第2次免疫時(shí)，選擇大鼠右后足進(jìn)行注射免疫。因此，在實(shí)驗(yàn)期間造模大鼠普遍為右后足嚴(yán)重腫脹，其余足不同程度腫脹。在給藥前，按炎癥評(píng)分指數(shù)(大鼠四足評(píng)分之和)分層隨機(jī)分組，踝關(guān)節(jié)腫脹度、足跖腫脹度測量部位為大鼠右后足；給藥后，大鼠右后足腫脹消退緩慢，而繼發(fā)性腫脹消退較快。與模型組比較，厚藤提取物各治療組大鼠炎癥指數(shù)評(píng)分明顯降低，而踝關(guān)節(jié)腫脹度、足跖腫脹度降低但無顯著性差異(P>0.05)。

RA病情發(fā)生與多種細(xì)胞因子密切相關(guān)。在RA模型中，PGE2發(fā)揮著關(guān)鍵作用，炎性因子PGE2可以增強(qiáng)單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的趨化性，刺激淋巴細(xì)胞的增殖和細(xì)胞因子的釋放[10]，PGE2過度表達(dá)可使血管舒張，微循環(huán)通透性增加，加重滲出與水腫，誘導(dǎo)軟骨破壞，從而加重RA炎癥反應(yīng)[11,12]。RF作為一種特異性抗體，由RA產(chǎn)生，RF表達(dá)升高，可加重患者器官功能的損傷[13]。CRP最早在肺炎球菌感染病人中發(fā)現(xiàn)，屬于急性期蛋白，在發(fā)生炎癥、組織損失時(shí)，表達(dá)水平迅速上升，在臨床上常被用作診斷炎性反應(yīng)、免疫防御功能的標(biāo)志物[14,15]。RF和CRP與RA疾病發(fā)展密切相關(guān)，可作為診斷和判定RA嚴(yán)重程度的指標(biāo)[16，17]。

4 結(jié)論

本研究評(píng)價(jià)了厚藤提取物對(duì)CIA模型大鼠的抗炎作用，結(jié)果顯示，厚藤提取物對(duì)CIA大鼠有減輕腫脹、緩解滑膜炎癥狀的作用，其對(duì)CIA大鼠關(guān)節(jié)的保護(hù)作用可能是通過降低血清中PGE2、RF、CRP表達(dá)水平，從而抑制炎癥反應(yīng)，其具體分子作用機(jī)制還需深入探究。