基于網絡藥理學的蒲黃對血瘀證的作用靶點與代謝通路研究*

黃曉霞，趙唯君，吳相親，王凱洋，曾 露，王紅剛，梁生旺，羅 蘭

(廣東藥科大學中藥學院，廣東廣州 510006)

0 引言

血瘀證是由瘀血內阻引起的病癥，是中醫證候研究領域的熱點[1]。現代醫學認為，血瘀證主要表現在血流動力學、血液流變學、血栓、微循環障礙、血管內皮損傷、炎癥等方面，會導致各組織器官水腫、炎癥滲出、血栓形成、組織變性、結締組織增生等病理變化，是臨床上常見的證候之一[2-4]。有研究表明，蒲黃(Pollentyphae)對血瘀證具有比較明確的治療作用，如孔祥鵬等[5]通過對血瘀模型大鼠的研究，認為蒲黃可改變異常的血液流變學，降低纖維蛋白原含量從而起到化瘀的作用；劉鵬和周軍[6]認為蒲黃可以改變局部血液循環，促進血管及纖維組織增生；楊梓超等[7]研究發現,蒲黃提取物可以下調糖尿病視網膜病變中的炎癥水平；過鑫昌等[8]通過臨床雙盲實驗研究證實蒲黃能影響血脂，降低血清總膽固醇含量，降低血小板黏附率，從而影響血小板功能，對血管內皮細胞具有修復作用并抑制粥樣斑塊的形成。目前，作為活血化瘀藥，蒲黃對血液流變學指標有改善作用[9]，且可改善糖尿病大鼠血液中炎癥因子的水平[10]，對急性血瘀大鼠的藥代動力學作用明顯[11]，但其發揮治療作用的可能藥效物質基礎及作用機制尚不明確。

蒲黃主要含有黃酮類、甾體、有機酸、烷烴、揮發油、多糖等化學物質[12]，具有止血、化瘀、通淋等功效。蒲黃總黃酮可顯著改善急性血瘀證家兔的血液流變學，并抑制血小板聚集[13]；Wang等[14]研究表明，蒲黃總黃酮是活血化瘀的主要活性成分。蒲黃黃酮類成分槲皮素、異鼠李素、柚皮素等均可抑制血小板聚集[15-17]；花生四烯酸在體內被迅速代謝，其代謝物參與細胞免疫及炎癥反應[18]；山奈酚可抑制炎癥因子，具有抗炎作用[19]。上述研究成果揭示以上化合物可能是治療血瘀證的主要活性成分。

網絡藥理學(Network pharmacology)基于在線的數據庫、平臺和作圖軟件等，依據中藥多成分、多靶點、多途徑的整體研究思路，通過數據挖掘、分析以及數據可視化等闡明藥物的分子作用機制網絡。前期本實驗課題組采用LC-MS方法對蒲黃中的主要化學成分進行定量分析[20]，本實驗基于整體觀，在前期研究基礎上采用網絡藥理學方法，篩選蒲黃活性成分及其作用靶點、通路，保留與血瘀證相關的靶點，并與陽性藥阿司匹林分子對接強度比較，以此探討其治療血瘀證的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 蒲黃活性成分和作用靶點的篩選

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)搜索蒲黃全部的化學成分，以口服利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%和類藥性(Drug-Likeness，DL)≥0.18兩個ADME (藥物在體內的吸收Absorption、分布Distribution、代謝Metabolism、排泄Excretion過程)參數為篩選條件，初步篩選出蒲黃活性成分及其作用靶點，并根據潘祥龍等[2]的研究成果補充蒲黃中具有活血化瘀功效的化合物。經文獻篩選補充的化合物在TCMSP數據庫進行檢索匹配，若TCMSP未收載，則利用Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載化合物分子的3D結構并導入Swiss TargetPrediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)預測活性成分的作用靶點。對獲得的蛋白質靶點統一使用Uniprot蛋白質數據庫(https://www.uniprot.org/)進行規范。

1.2 蒲黃活性成分作用靶點的篩選

將1.1節初步篩選出的作用靶點輸入PharmGKB數據庫(https:/org//www.Pharmgk-b)、TTD數據庫(http://db.i drblab.net/ttd/)、CTD數據庫(http://ctdb ase.org/)，篩選出蒲黃活性成分的作用靶點，保留與血瘀證相關的靶點，舍去非相關靶點。

1.3 蒲黃成分-靶點圖的構建

運用Cytoscape3.8.2對結果進行可視化，構建蒲黃成分-靶點圖，用“節點(node)”表示成分或靶點或通路，用“邊(edge)”表示節點之間的關系。利用Cytoscape3.8.2軟件內置工具(network analyzer)分析網絡拓撲結構，以連接度(Degree)、介度(Betweenness Centrality)與緊密度(Closeness Centrality)的數值為主要參考，識別活性成分、作用靶點和通路。

1.4 蒲黃活性成分作用靶點的PPI網絡構建

為明晰靶點間的相互作用，將1.2節篩選出的蒲黃活性成分作用靶點提交到STRING11.0數據庫(https://string-db.org/)，以“Homo sapiens”為篩選條件，構建蛋白質相互作用(PPI)網絡，設定閾值“highest confidence”>0.9，其余條件均為默認。利用Metascape平臺(https://metascape.org/gp/index.html)挖掘PPI網絡中潛在的功能模塊，并對功能模塊進行描述。

1.5 疾病-靶點圖構建

運用Cytoscape3.8.2對結果進行可視化，構建疾病-靶點圖，其他步驟與1.3節一致。

1.6 蒲黃活性成分作用靶點功能與通路富集分析

利用Metascape平臺將蒲黃活性成分作用靶點進行基因本體論GO生物過程分析(GO Biological Processes)、GO分子功能分析(GO Molecular Functions)、GO細胞組分分析(GO Cellular Components)、KEGG通路富集分析(KEGG Pathway)，分析條件均為默認參數，并對所得結果進行可視化。

1.7 蒲黃成分-靶點-通路網絡圖的構建

運用Cytoscape3.8.2對結果進行可視化，構建成分-靶點-通路圖，其他步驟與1.3節一致。

1.8 分子對接分析

為進一步明晰化合物與靶點結合的活性，利用AutoDock Vina(v4.2.6)軟件對蒲黃的活性成分和關鍵作用靶點進行分子對接，同時將陽性藥阿司匹林Aspirin與關鍵作用靶點進行分子對接。分子對接的步驟主要如下：①收集蒲黃活性成分作用的關鍵靶點的結構和活性成分的結構——從PDB數據庫下載關鍵作用靶點的3D結構，從TCMSP和Pubchem數據庫下載活性成分的mol2或3D結構；②對關鍵作用靶點和活性成分進行預處理——使用Discovery Studio 4.5對蛋白質結構進行處理，刪除水分子、配體、離子，加極性氫和電荷等，并將化合物轉成PDB文件；③配體(活性成分)和分子(靶點)的對接——對接過程中，將蒲黃活性成分和關鍵作用靶點的PDB文件轉化成pdbqt文件，通過查閱文獻設置盒子參數，而后進行柔性對接；④對接結果的可視化——使用PyMOL(2.4.1)將對接結果可視化。

2 結果與分析

2.1 蒲黃活性成分的獲取

利用TCMSP數據庫收集33個化學成分，經ADME篩選得到8個活性成分，加上潘祥龍等[2]報道的活性成分8個，總共16個活性成分(表1)。

表1 蒲黃活性成分

2.2 蒲黃活性成分作用靶點的確定

通過在線數據庫對蒲黃活性成分的作用靶點進行收集，共獲得539個靶點，去除重復靶點后為310個。將310個靶點錄入CTD、TTD和PharmGKB數據庫，對靶點進行分類，主要根據改善血流動力學、抗凝血、抗炎和調控細胞凋亡(增殖)等4個方向進行分類[21]。最終確定與血瘀證相關的作用靶點83個，并與蒲黃16個活性成分相互作用。

2.3 蒲黃成分-靶點網絡圖

為觀察蒲黃活性成分和靶點之間的關系，使用Cytoscape3.8.2軟件對數據進行可視化，獲得成分-靶點網絡圖，其中節點98個，邊166條(圖1)。拓撲屬性分析顯示，槲皮素、7-羥基-5,8-二甲氧基-黃烷酮、山奈酚的連接度較高(表2)。

圖1 蒲黃成分-靶點網絡圖

表2 蒲黃活性成分的拓撲屬性

2.4 蒲黃活性成分作用靶點PPI網絡的構建

通過提交靶點至STRING 11.0數據庫，獲得蒲黃活性成分作用靶點的PPI網絡(圖2)。同時分析PPI網絡拓撲屬性，以連接度(Degree)為指標，連接度值越大，說明靶點連接越緊密，進而說明靶點越重要。分析結果顯示，處于蒲黃活性成分作用靶點中心的蛋白，腫瘤壞死因子(TNF，度值=15)、血管內皮生長因子(VEGFA，度值=14)、轉錄因子(JUN，度值=14)、有絲分裂原激活蛋白激酶14 (MAPK14，度值=14)、蛋白激酶(AKT1，度值=13)、雌激素受體(ESR1，度值=10)等相互聯系較為緊密，揭示蒲黃的活血化瘀網絡中存在連線密度較高的子網(module)，子網由具有生物學意義的蛋白質復合體和功能

圖2 蒲黃活性成分作用靶點PPI網絡圖

模塊組成[22]，同時表明TNF、VEGFA、JUN、MAPK14、AKT1、ESR1可能為蒲黃活性成分作用的關鍵靶點。上述蛋白質涉及細胞增殖和凋亡、血管內皮生成、癌細胞生長的抑制、免疫反應和炎癥反應的參與等方面。采用分子復合物檢測算法(MCODE)對相互作用關系進行分析，得到4個module，選取與蒲黃活血化瘀藥理相關的3個module (圖3)進行描述，結果發現這些module主要涉及對脂多糖的應答、炎癥反應和對細菌起源分子的應答等生物過程(表3)。推測蒲黃活血化瘀作用可能與上述過程有關。

紅色表示module 1，藍色表示module 2，綠色表示module 3

表3 蒲黃活性成分作用靶點PPI網絡功能描述

2.5 疾病-靶點的網絡圖構建

為了更直觀地觀察靶點和疾病的關系，構建疾病-靶點網絡圖，如圖4所示。將靶點分為7個特征病癥(這7個特征病癥與血瘀證對應的4個模塊關聯):癌癥(Cancer)、血管疾病(Vascular diseases)、免疫系統疾病(Immune system diseases)、神經系統疾病(Nervous system diseases)、炎癥(Imflammation)、疼痛(Pain)及其他疾病(Other diseases)，與傳統的血流動力學異常、凝血異常、炎癥反應和腫瘤對應。表明蒲黃治療血瘀證可能與7個方面的病癥相關。

圓形表示靶點，八邊形表示疾病

2.6 蒲黃活性成分作用靶點功能和通路的富集分析

通過Metascape平臺對蒲黃活性成分作用的83個靶點進行通路富集分析，并使用在線平臺對前20條結果進行可視化(圖5)。蒲黃治療血瘀證相關的生物過程主要有對脂多糖的應答(Response to lipopolysaccharide)、對受傷的反應(Response to wounding)和血液循環(Blood circulation)等(圖5a)。與血瘀證有關的通路有血管新生相關的VEGF信號通路(VEGF signaling pathway)，IL-17信號通路(IL-17 signaling pathway)，NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)等(圖5d)。與血瘀證有關的靶點功能主要體現在蛋白激酶(Protein kinase binding)、內肽酶活性(Endopeptidase activity)、細胞因子受體結合(Cytokine receptor binding)等方面(圖5c)。與血瘀證相關的細胞組分有細胞器外膜(Organelle outer membrane)、血漿脂蛋白顆粒(Plasma lipoprotein particle)、核膜(Nuclear envelope)等(圖5b)。表明蒲黃治療血瘀證可能與以上描述有關。

圖5 蒲黃活性成分作用靶點通路富集分析

2.7 蒲黃成分-靶點-通路網絡圖的構建

為系統地剖析蒲黃治療血瘀證的潛在機制，將83個蛋白質靶點映射到前20條KEGG通路上(圖6)。結果顯示，VEGF信號通路富集靶點15個，IL-17信號通路富集靶點13個，NF-κB信號通路富集靶點13個，這3個通路與血瘀證關聯較緊密。這些富集多靶點的通路與血管、中樞神經系統、炎癥密切相關，通路富集的靶點信息見表4。

不同的顏色表示不同的類型，淺綠色為靶點，淺紫色為蒲黃活性成分，藍色為通路。圖形面積越大，表示該節點越重要

表4 主要通路富集的靶點信息

續表4

2.8 分子對接結果分析

選取PPI網絡中連接度值排前5的靶點，TNF、VEGFA、JUN、MAPK14和AKT1分別和16個與血瘀證相關的蒲黃活性成分、Aspirin進行分子對接。經研究發現，受體和配體的結合能小于-7，表示兩者間具有較好的結合作用；結合能數值越低，產生相互作用所需的能量就越低[23]。圖7為16個化合物分別與5個核心靶點進行對接的結合能。由圖7可知，結合能小于-7的有42種(49.41%)，位于-5與-7之間的有31種(36.47%)，在-1與-4.9之間的有12種(14.12%)。蒲黃成分異鼠李素-3-O-新橙皮苷、(2R)-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)苯并吡喃-4-酮、兒茶素和表兒茶素等與受體結合可產生5個以上的氫鍵作用(圖8)，具有良好的活性。Aspirin與TNF的結合能最低為-6.6，與蒲黃活性成分相比稍差。結合能小于-5的表示結合活性良好[24]，占總數的85.88%。經過分子對接驗證，說明蒲黃活性成分對治療血瘀證具有較好的活性。

顏色越紅，對應的值越小，說明對接強度越大

圖8 蒲黃主要成分和靶點的對接結果

3 討論

隨著現代醫學的進步，對血瘀證研究越來越深入，較古代判斷疾病的“問、聞、望、切”，現代醫學更多的是研究疾病的發病機制以及藥物對疾病的作用機制，并已經發展到分子層面。由表1可知，蒲黃的活性成分有81.25%是黃酮類化合物。本課題組前期實驗表明，生蒲黃和蒲黃炒炭后黃酮類成分變化具有明顯差異，并與藥效的變化有關[25]，可推斷蒲黃總黃酮是重要的活性成分，與本文推斷的結果一致。

研究分析PPI網絡可知，VEGFA、AKT1、ESR1、TNF、JUN、MAPK14的連接度值在PPI網絡中排名前6，說明蒲黃活性成分與這些靶點具有較高的結合活性。VEGFA是參與血管新生的相關因子，該因子可刺激血管內皮細胞分裂增殖，并與炎癥指標、疾病活動及血管通透性呈正相關關系，參與固有的免疫調節[26]。AKT1在血管細胞中是以亞型存在，影響血管化反應的多個調控途徑，包括抗血管生成、調節血管通透性、血管生成反應和血管成熟[27]。靶點 ESR1調節血管系統，促進損傷血管功能的恢復，并在中樞神經系統中起保護神經的作用[28]。以上研究成果證實PPI網絡篩選的靶點可能與血瘀證密切相關，其中VEGFA、AKT1、ESR1、TNF、JUN、MAPK14可能是治療血瘀證的關鍵靶點。

KEGG通路富集結果可知，在蒲黃治療血瘀證過程中涉及的通路可能與VEGF信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路有關。如NF-κB信號通路中的促炎因子、TNF-α、AngⅡ等多種刺激因子被誘導后，在下游調節白細胞介素相關基因、凋亡抑制因子、編碼黏附因子相關基因等多種基因的表達，涉及機體免疫調節、炎癥反應、細胞周期調控、細胞分化及凋亡等，與Notch信號通路有關，與IKK激酶、IκB激酶的細胞內信號有關。在炎癥中，TNF-α、IL-6、NF-κBP65等促炎細胞因子增加，NF-κB炎癥基因的表達增加。IL-17信號通路中的IL-17F、IL-25也具有促炎作用[29]。VEGF信號通路與下游信號聯級反應，包括PI3K-Akt通路、p38-MAPK通路及Raf通路，進而控制血管內皮細胞的存活、增殖和遷移，促進血管新生并提高血管通透性。血管生成是腫瘤發生發展的重要因素，新生血管不僅為病變組織提供養分，保證其生長繁殖，而且使得腫瘤細胞與個體血液循環直接相通，進而導致惡性腫瘤的發生。上述結果表明，蒲黃治療血瘀證可能與VEGF信號通路、IL-17信號通路、NF-κB信號通路等有關。

通過網絡藥理學的篩選，選取PPI網絡中聯系緊密的VEGFA、AKT1、TNF、JUN、MAPK14 5個靶點，分別與蒲黃活性成分對接，進一步驗證其結合活性，同時將陽性藥Aspirin與上述5個靶點進行對接。可視化對接結果顯示,表兒茶素與VEGFA、異鼠李素-3-O-新橙皮苷與MAPK14、兒茶素與MAPK14的結合強度較好，Aspirin與5個靶點的結合強度較表兒茶素、異鼠李素-3-O-新橙皮苷、兒茶素弱。Aspirin在治療血瘀證方面療效明確且顯著，而蒲黃活性成分的對接結果優于陽性藥Aspirin，表明蒲黃在治療血瘀證方面具有極大的潛力，開發價值較大，后續可對其進一步研究。

4 結論

通過網絡藥理學初步揭示蒲黃多成分、多靶點、多通路的作用特點，發現蒲黃活性成分作用靶點可分為7個病癥，這7個特征病癥與血瘀證的4個模塊相關聯，預測蒲黃治療血瘀證的可能作用靶點和代謝通路；從分子對接結果來看，蒲黃活性成分異鼠李素-3-O-新橙皮苷、(2R)-5,7-二羥基-2-(4-羥基苯基)苯并吡喃-4-酮、兒茶素和表兒茶素等的對接效果均優于陽性藥Aspirin。本研究粗略說明了蒲黃治療血瘀證的分子機制，不僅為蒲黃的活血化瘀作用提供了理論依據，為將來相關研究提供了基礎，而且為傳統中藥材作用機制的研究提供新的思路。