大黃的炮制對生大黃、熟大黃5種游離蒽醌含量的影響測定*

張 如，魏江存，馬家寶，楊正騰△，王成龍

1廣西壯族自治區婦幼保健院，廣西 南寧530003；2廣西國際壯醫醫院；3廣西中醫藥大學第一附屬醫院

大黃屬中藥瀉下藥，始載于《神農本草經》，為蓼科植物掌葉大黃Rheum palmatumL.，唐古特大黃Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃Rheum officinaleBaill.的干燥根和根莖［1］。掌葉大黃和唐古特大黃被稱為“北大黃”，主產于青海、甘肅等地；藥用大黃稱為“南大黃”，主產于四川、陜西等地［2］。我國有45個品種和2個亞種的大黃，但2015版《中華人民共和國藥典》只收錄3種大黃，即正品大黃、唐古特大黃和藥用大黃的干燥根及根莖，主要有效成分有蘆薈大黃素、大黃素、大黃酸、大黃酚、大黃素甲醚、沒食子酸、番瀉苷類、鞣質、大黃多糖和微量元素等成分［3-4］。大黃性苦、寒，歸脾、胃、大腸、心、肝經，其藥理作用非常廣泛，如：瀉下、消炎、抗菌、抗病毒、利膽、止血、降血脂、降血壓等［5-6］。

炮制是提高中藥臨床療效的重要手段，炮制后藥物藥性改變，成分變化［7-13］，根據辨證施治的需要，合理選用不同的炮制品，才能提高中藥的療效，減少毒副作用［14-16］。臨床應用大黃時除了使用生品外，也常使用炮制品，其中以生大黃、熟大黃、酒大黃、大黃炭最為常用，2015版《中華人民共和國藥典》收載有生大黃、酒大黃、熟大黃、大黃炭4種炮制品。

中藥大黃含有多種有效成分，在加熱蒸炒炮制過程中，其所含有效成分含量變化很大，藥效也隨之發生改變［9，12］。筆者采用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）同時測定生、熟大黃中5種游離蒽醌成分，為綜合評價大黃不同炮制品質量提供了方法。

1 材料

1.1 試藥與試劑蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚（純度＞98%，上海融禾醫藥科技有限公司，批號：160520、170219、170224、160124、160602）；甲醇（美國Fisher科學世界公司，色譜純）；甲醇（國藥集團化學試劑有限公司，分析純）；乙醇（國藥集團化學試劑有限公司；分析純）；水為超純水，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器Waters 2695型高效液相色譜儀（包括2489UV，四元泵、真空脫氣泵、自動進樣器、柱溫箱和Empower3液相工作站）；純水儀（法國，密理博）；PRACTUM224-KN SOP型電子分析天平［賽多利斯科學儀器（北京）有限公司］；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵（鄭州長城科工貿有限公司）；DHG-9203A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海齊欣科學儀器有限公司）；TGL-16G型高速臺式離心機（上海安亭科學儀器廠）；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；45 μm微孔濾膜。

1.3 大黃的炮制工藝

1.3.1 生大黃［17-19］取原藥材除雜，大小分開，清洗干凈，用清水浸泡約六成透，撈出，燜潤到內外濕度一致時，切成片，晾干或烘干，篩去碎屑即可。現代研究表明，大黃中結合性大黃酸苷類等瀉下成分煎煮10 min左右，煎出量最高，久煎后多被破壞。故生大黃片用于瀉下時，應后下，且煎煮時間不宜長，否則瀉下作用減弱。見圖1。

1.3.2 熟大黃［18，20］將大小分檔的洗凈大黃片用黃酒拌勻，燜潤至黃酒全部被吸盡，放入蒸制容器內密閉，置水鍋上武火加熱蒸4～6 h（注意隨時加水，避免干鍋）至大黃內外均呈黑褐色時取出，曬干或烘干。大黃∶黃酒=100∶0～30。生大黃片經蒸熟后，它的瀉下及收斂作用明顯減弱，作用比較緩和；在炮制過程中，產生較多的大黃素等，增強其清熱解毒的作用。臨床上一般用于熱毒引起的火毒瘡瘍等癥。見圖2。

圖2 熟大黃

2 方法與結果

2.1 色譜條件使用Thermo BDS HYPERSIIC18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱，流動相甲醇-0.1%磷酸（85∶15），檢測波長256 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，進樣量10 μL，按照上述條件各組分分離度良好。見圖3。

圖3 大黃混合對照品及生、熟大黃供試品的HPLC色譜圖

2.2 對照品溶液制備1）分別精密稱取蘆薈大黃素12.94 mg，大黃素12.69 mg，大黃酸14.34 mg，大黃酚12.33 mg，大黃素甲醚13.67 mg，分別加入甲醇使之溶解，蘆薈大黃素和大黃素分別定容至25 mL容量瓶中，大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚分別定容至10 mL容量瓶中，即得各對照品儲備液。2）分別精密量取蘆薈大黃素和大黃素對照品儲備液1 mL，大黃酸、大黃酚和大黃素甲醚對照品儲備液3 mL，置于25 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，即得混合對照品溶液，即蘆薈大黃素20.7 μg/mL，大黃酸172.1 μg/mL，大黃素20.3 μg/mL，大黃酚148.0 μg/mL，大黃素甲醚164.0 μg/mL。

2.3 大黃供試品溶液制備分別取大黃不同炮制品粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定質量，加熱回流1 h，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 線性關系考察分別精密吸取大黃混合對照品溶液1、2、5、8、12、15、20 μL注入液相色譜儀，各進樣1次，測定峰面積，分別以峰面積和進樣量（μg）為縱坐標和橫坐標，繪制標準曲線并計算回歸方程。精密吸取上述大黃蒽醌類混合對照品稀釋液，進樣，測定其信號（以峰高計算）與噪聲比值，將S/N=3時的濃度定為檢測限（LOD），將S/N=10時的濃度定為定量限（LOQ）。可得蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚回歸方程式分別為：Y=5.0×106X-21952（r=0.9999），Y=3.0×106X-352285（r=0.9996），Y=4.0×106X-19323（r=0.9998），Y=6.0×106X-324544（r=0.9999），Y=850954X-64874（r=0.9993）；分別在0.0207～0.414、0.1721～3.442、0.0203～0.406、0.148～2.96、0.164～3.28線性范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗精密量取混合對照品溶液適量，按“2.1”項下條件連續進樣6次，分別記錄各自的峰面積，并計算蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD（%）。結果測得混合對照品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD值分別為0.70%、0.70%、0.37%、0.35%和0.42%，RSD都小于3.0%，表明所用液相色譜儀的精密度良好。

2.6 穩定性試驗取大黃粉末0.5 g，精密稱定，按“2.3”項下的方法制備成供試品溶液，分別于供試品溶液制備后0、2、4、8、12、24 h按“2.1”項下條件依法測定各供試品的峰面積，結果測得生大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.62%、0.34%、0.29%、0.19%、0.21%；熟大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為0.93%、0.14%、0.13%、0.19%、0.22%。RSD都小于3.0%，說明24 h內供試品溶液穩定性良好。

2.7 重復性試驗精密稱取生大黃和熟大黃藥材粉末0.5 g，精密稱定，每種炮制品均稱取6份，按“2.3”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下條件依法測定各供試品的峰面積，計算生大黃和熟大黃中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量，結果測得生大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚平均含量分別為1.7794、5.1054、2.5204、5.3456、5.8814 mg/g；熟大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均含量分別為1.8396、4.8026、2.6820、6.7914、7.4956 mg/g；生大黃的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的RSD分別為0.54%、0.90%、0.86%、0.54%、1.03%；熟大黃中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚測的RSD分別為1.35%、0.69%、0.57%、0.80%、0.69%。RSD都小于3.0%，表明該方法重現性良好。

2.8 加樣回收率試驗精密稱取大黃藥材粉末0.25g，精密稱定，共9份，分成3組，即低、中、高加樣組（0.25g藥材含量的80%、100%和120%加樣），每組分別加入混合對照品溶液（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚），按“2.3”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，計算生大黃低、中、高加樣組中的蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均回收率和其RSD值。結果見表2—3，表明該方法準確性良好。

表2 生大黃加樣試驗結果

續表2

表3 熟大黃加樣試驗結果

續表3

2.9 樣品含量測定分別稱取大黃不同炮制品藥材粉末（過2號篩）0.5 g，各3份，精密稱定質量，按“2.3”項下的方法制備成供試品溶液，按“2.1”項下條件測定，采用外標一點法計算大黃素、大黃酸、蘆薈大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。見表4。

表4 生、熟大黃含量測定結果

3 討論

3.1 流動相的選擇本試驗采用HPLC測定大黃游離蒽醌，對其流動相進行了選擇，發現流動相中加入不同種類的酸對5種游離蒽醌的分離有很大的影響。本試驗采用甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）、甲醇-0.2%磷酸溶液（85∶15）、甲醇-0.1%冰醋酸溶液（85∶15）、甲醇-0.2%冰醋酸溶液（85∶15）和甲醇-0.1%冰醋酸溶液（85∶15）等流動相選擇試驗比較，認為以甲醇-0.1%磷酸溶液（85∶15）作為流動相，大黃5種游離蒽醌分離效果較好，與雜峰達到基線分離。因此認為本法快速、重復性好、穩定，可用于大黃炮制原理、工藝、質量等研究。

3.2 含量變化分析生大黃用黃酒拌勻，燜潤至黃酒全部被吸盡，放入蒸制容器內密閉武火加熱蒸制后，其5種游離蒽醌與生品大黃相比含量有所變化，根據以上的含量測定結果表明，蘆薈大黃素含量下降約8.26%，大黃酸下降約9.21%；而大黃素含量增加約16.44%，大黃酚增加約16.12%，大黃素甲醚增加約20.01%，說明炮制工藝對中藥大黃各成分影響不相同。熟大黃游離蒽醌類成分比例發生了變化，根據熟大黃多年臨床使用證明，這5種游離蒽醌成分比例可能是熟大黃最佳的療效組合，而這種成分比例的變化重新組合，可能是導致其瀉下和收斂作用明顯減弱，作用比較緩和；在炮制過程中，產生較多的大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等，增強其清熱解毒的作用。臨床上一般用于熱毒引起的火毒瘡瘍等癥。

3.3 藥理相關性分析在蒸制的過程中，蒸氣加熱，溫度高，破壞了主要瀉下成分的結合型大黃酸，使其瀉下作用下降；而大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量增加，可抑制血小板凝集，降低血小板活性，使凝集狀態得到改善，滲透壓趨于正常。因此，熟大黃相對于生大黃來說，有更好的活血祛瘀的功效。生大黃經炮制后，其藥效發生了一些改變，治療范圍擴大［9，12，21-22］。同時，經過炮制，熟大黃對胃腸道刺激較生大黃有所下降。不同的中藥炮制方法，產生大黃的不同炮制品，其治療疾病也會產生差異，所以臨床上要辨證施治，合理使用大黃及其炮制品。