葡萄密度對(duì)所釀酒酚類(lèi)物質(zhì)含量及抗氧化活性的影響研究

許凌凌，夏夢(mèng)秋

(1.蕪湖職業(yè)技術(shù)學(xué)院 生物工程學(xué)院，安徽 蕪湖 241002；2.蕪湖市生命健康工程技術(shù)研究中心，安徽 蕪湖 241000)

巨峰葡萄(Kyoho grape)原產(chǎn)于日本，20世紀(jì)60年代引入我國(guó)并大規(guī)模推廣種植[1]。因其價(jià)格較低、口感較好，已成為我國(guó)當(dāng)前葡萄栽培的主要品種之一[2]。巨峰葡萄果實(shí)酸甜可口，果形較大，柔軟多汁，其釀造的葡萄酒具有豐富的維生素及礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)成分，且具有較高的食用價(jià)值[3]。葡萄酒以新鮮葡萄或葡萄汁為原料，經(jīng)全部發(fā)酵或部分發(fā)酵制成含有一定酒精度的發(fā)酵酒[4]。我國(guó)葡萄酒的消費(fèi)量偏低，人均年消費(fèi)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于世界人均水平，但是我國(guó)葡萄酒消費(fèi)需求在逐年增長(zhǎng)，葡萄酒產(chǎn)業(yè)蓬勃發(fā)展。在我國(guó)釀酒葡萄品種中，赤霞珠占80%[5]，其余為美樂(lè)等品種，這造成了我國(guó)葡萄酒產(chǎn)業(yè)同質(zhì)化現(xiàn)象。為解決這一問(wèn)題，迎合消費(fèi)者對(duì)不同風(fēng)味葡萄酒的消費(fèi)需求，釀造出風(fēng)味不同的葡萄酒已成發(fā)展趨勢(shì)。

在同一個(gè)果園或者同一棵植物中，成熟過(guò)程中農(nóng)產(chǎn)品的異質(zhì)性幾乎是普遍存在的[6]，一般來(lái)說(shuō)，土壤條件、氣候、品種、水分、施肥、收獲日期及田間管理等農(nóng)業(yè)生態(tài)因素影響著水果的成熟度[7]。Caccavello等[8]研究結(jié)果表明成熟期內(nèi)葡萄存在明顯的異質(zhì)性，成熟期葡萄密度對(duì)其理化性質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)影響顯著，高密度葡萄成熟度較高，品質(zhì)較好。王軍等[9]對(duì)無(wú)核白葡萄的研究結(jié)果也得到了相同的結(jié)論。此外，在不同成熟度葡萄中，芳香成分、色澤和質(zhì)地的變化也得到了廣泛研究[10]。葡萄的成熟度不僅會(huì)影響原料的理化性質(zhì)，還會(huì)影響后續(xù)加工產(chǎn)品質(zhì)量，果實(shí)異質(zhì)性對(duì)后續(xù)深加工存在顯著影響[11]。

酚類(lèi)物質(zhì)影響葡萄和葡萄酒的顏色和苦澀感，是評(píng)價(jià)葡萄和葡萄酒質(zhì)量的重要指標(biāo)。同時(shí)酚類(lèi)物質(zhì)具有抗氧化、抗菌、抗癌等特性，對(duì)于人體具有較高的保健功效[12-13]。葡萄及葡萄酒中富含豐富的酚類(lèi)物質(zhì)，其含量主要與品種、栽培方式、氣候、植株整形方式有關(guān)。關(guān)于果實(shí)密度對(duì)其葡萄酒酚類(lèi)物質(zhì)含量及其抗氧化活性變化的影響研究較少，且葡萄酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要來(lái)源其多酚類(lèi)物質(zhì)及與其貢獻(xiàn)的抗氧化能力，因此采用合理方法對(duì)采收期葡萄進(jìn)行分級(jí)，并對(duì)分級(jí)后葡萄所釀酒的酚類(lèi)物質(zhì)及抗氧化能力進(jìn)行分析，對(duì)葡萄酒品質(zhì)控制具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

以市售成熟巨峰葡萄(果皮全紫)為實(shí)驗(yàn)材料；所需試劑及生產(chǎn)廠家所需試劑及生產(chǎn)廠家如下所示。Lafazym Arom果膠酶、帝伯仕18度酵母，煙臺(tái)良緣酒業(yè)有限公司；偏重亞硫酸鈉、乙醇、磷酸、磷酸二氫銨、福林酚，天津市博迪化工有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)品：兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯、綠原酸、咖啡酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、沒(méi)食子酸、香草酸、水楊酸、龍膽酸、反式白藜蘆醇，上海一基生物試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)、Trolox、福林酚試劑均購(gòu)買(mǎi)自Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

JD400-3型電子分析天平，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；KQ-700DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；1525型二元高壓液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；UV-1600型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海安亭生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 葡萄成熟度分級(jí)

如表1所示，利用葡萄在氯化鈉溶液中的密度浮沉進(jìn)行成熟度分級(jí)[9]，葡萄去梗后清水洗凈，將洗凈晾干的葡萄放置于配好的鹽水溶液中，根據(jù)不同成熟度葡萄的特性(密度高的沉下去，密度低的浮起來(lái))進(jìn)行分級(jí)。不同成熟度葡萄在鹽水中的密度分級(jí)如表1所示(相鄰密度的葡萄歸前一密度階段所有，例如：對(duì)應(yīng)密度為1078kg/m3的葡萄歸為S1成熟階段，以此類(lèi)推)。

表1 葡萄按不同密度進(jìn)行分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 釀造工藝

葡萄酒的釀造工藝參考周書(shū)來(lái)等[14]人的方法：將分級(jí)完成的葡萄清水洗凈并晾干后破碎，調(diào)整糖度為20°Bx，pH值為4.0，然后加入0.02%的亞硫酸鈉，按體積分?jǐn)?shù)5%接種擴(kuò)大培養(yǎng)的酵母菌，25℃條件下發(fā)酵，發(fā)酵6d后補(bǔ)加釀酒酵母培養(yǎng)液和蔗糖，使用干凈紗布蓋住罐口并早晚壓帽一次，定時(shí)測(cè)量比重及溫度，比重降至1時(shí)進(jìn)行皮渣分離，繼續(xù)發(fā)酵至比重為0.995左右，穩(wěn)定后加入60mg/L的SO2終止發(fā)酵，滿(mǎn)罐密封15d，陳釀120d(不同成熟度葡萄發(fā)酵時(shí)間略有差異，后續(xù)滿(mǎn)罐密封及陳釀時(shí)間從加入SO2后計(jì))。

1.3.3 葡萄及葡萄酒中基本理化指標(biāo)的測(cè)定

葡萄及葡萄酒中可溶性固性物、總酸、pH、酒精度的測(cè)定參考王沙沙[15]等人的方法。

1.3.4 總酚、總黃酮、總黃烷醇、總花色苷含量測(cè)定

以沒(méi)食子酸為當(dāng)量，福林酚法測(cè)定葡萄酒中總酚的含量[16]；以槲皮素為當(dāng)量，三氯化鋁法測(cè)定葡萄酒中總黃酮含量[17]；以?xún)翰杷貫楫?dāng)量，對(duì)二甲氨基肉桂醛(4-Dimethylaminocinnamaldehyde,P-DMACA)法測(cè)定葡萄酒中總黃烷-3-醇含量[17]；以矢車(chē)菊素-3-葡萄糖苷為當(dāng)量，采用pH示差法測(cè)定葡萄酒中總花色苷含量[18]。

1.3.5 葡萄酒中單體酚類(lèi)物質(zhì)含量測(cè)定

取葡萄酒30mL，加入60mL乙酸乙酯進(jìn)行萃取，重復(fù)三次，真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，甲醇溶解后定容至10mL容量瓶中待測(cè)。對(duì)照品溶液的制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取15種對(duì)照樣品適量溶于甲醇中，分別配制濃度為0.01、0.02、0.04、0.08、0.10、0.12mg/mL的單標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品，15種對(duì)照品混標(biāo)的濃度皆為0.05mg/mL，測(cè)定前樣品與標(biāo)準(zhǔn)品過(guò)0.22μm濾膜。

利用高效液相色譜法測(cè)定葡萄酒中的單體酚類(lèi)物質(zhì)的含量。色譜柱：Waters XBridgeTM Shield RP18(4.6×250mm，3.5μm)，流動(dòng)相A：乙腈-冰醋酸(98:2，V/V)，流動(dòng)相B：水-冰醋酸(98:2，V/V)。流速為0.8mL/min，進(jìn)樣量為20μL，柱溫箱為30℃，洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

1.3.6 葡萄酒抗氧化能力測(cè)定

采用自由基清除法(DPPH)及鐵離子還原法(FRAP)對(duì)葡萄酒的抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定[18]，DPPH自由基清除能力的測(cè)定使用Trolox作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，結(jié)果以mM TE/L表示，F(xiàn)RAP鐵還原能力的測(cè)定使用維生素C作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品，結(jié)果以mM AAE/L表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄及葡萄酒基本理化指標(biāo)

相關(guān)研究表明：幾乎所有的葡萄在成熟過(guò)程中其可溶性固形物含量不斷升高、總酸含量降低[19-20]。由表3可知不同密度分級(jí)巨峰葡萄的可溶性固形物含量隨著成熟度的提高而不斷提高，其總酸含量隨著成熟度的提高而不斷降低，這也直接證明了密度分級(jí)法區(qū)分巨峰葡萄成熟度的可行性。不同成熟度巨峰葡萄發(fā)酵前后基本理化指標(biāo)如表3所示，其各指標(biāo)測(cè)定結(jié)果均符合國(guó)標(biāo)GB/T15037-2006對(duì)干紅葡萄酒的質(zhì)量要求，巨峰葡萄發(fā)酵后其總糖含量均低于4g/L，其酒精含量均高于12%，其總酸含量為6.2～6.5g/L，各指標(biāo)符合干紅葡萄酒的基本要求，滿(mǎn)足后續(xù)指標(biāo)測(cè)定要求。

表3 不同成熟度葡萄及所釀葡萄酒基本理化指標(biāo)分析

2.2 葡萄酒中總酚、總黃酮、總黃烷醇、總花色苷含量

酚類(lèi)物質(zhì)是葡萄酒中重要的功能活性物質(zhì)，不僅影響著葡萄酒的感官品質(zhì)，而且具有抗腫瘤、抗氧化、清除自由基等功效，對(duì)人體有著重要的生理功能[21]，因此測(cè)定不同成熟度葡萄所釀葡萄酒中酚類(lèi)物質(zhì)的含量至關(guān)重要。隨著葡萄成熟度的提高，葡萄酒中總酚含量顯著升高，具有顯著性差異(p<0.05)，這也與前人的研究結(jié)果一致[22]。如表4所示，不同成熟度葡萄所釀葡萄酒中總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷含量變化趨勢(shì)與總酚含量一致，總黃酮含量變化范圍為1155.4mg/L到1442.1mg/L；總黃烷-3-醇含量變化范圍為445.5mg/L到662.3mg/L；總花色苷含量范圍為54.1mg/L到98.2mg/L。

表4 不同成熟階段葡萄酒總酚、總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷含量(mg/L)

2.2.1 葡萄酒中黃烷-3-醇物質(zhì)含量

不同成熟度的巨峰葡萄所釀葡萄酒的四種黃烷-3-醇含量如表5所示，兒茶素、表兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯含量最高，是五個(gè)不同成熟階段葡萄所釀葡萄酒中最主要的黃烷-3-醇類(lèi)物質(zhì)，高含量的黃烷-3-醇類(lèi)物質(zhì)來(lái)源于發(fā)酵過(guò)程中皮籽的浸漬[17]。葡萄酒中表兒茶素、表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯含量隨著葡萄成熟度的提高而不斷降低，在S4、S5成熟階段的巨峰葡萄所釀葡萄酒中未檢測(cè)到表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯，隨著葡萄成熟度的提高，葡萄酒中兒茶素、表兒茶素沒(méi)食子酸酯與其他兩種黃烷-3-醇類(lèi)變化趨勢(shì)不同，呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，可能的原因?yàn)榫薹迤咸殉墒爝^(guò)程中不同酚類(lèi)物質(zhì)相互轉(zhuǎn)化。

表5 不同成熟度巨峰葡萄所釀葡萄酒中黃烷-3-醇含量(mg/L)

2.2.2 葡萄酒中黃酮醇及芪類(lèi)物質(zhì)含量

黃酮醇是類(lèi)黃酮的一大組分，葡萄果皮中的黃酮醇通過(guò)發(fā)酵轉(zhuǎn)移到葡萄酒中，并對(duì)葡萄酒的苦味和顏色有所貢獻(xiàn)[23]，不同成熟階段巨峰葡萄所釀酒中兩種黃酮醇(蘆丁，槲皮素)含量變化如表6所示，蘆丁為巨峰葡萄酒中最主要的黃酮醇，其含量范圍為1.4～3.8mg/L，且其含量隨著成熟度的提高呈現(xiàn)升高趨勢(shì)；在S1，S2成熟階段，葡萄酒中未檢測(cè)到槲皮素，槲皮素含量在S5成熟期達(dá)到最高為0.5mg/L。葡萄酒中反式白藜蘆醇是其最重要的芪類(lèi)物質(zhì)，品種、氣候條件、發(fā)酵過(guò)程都會(huì)對(duì)其含量造成顯著影響，由表6結(jié)果所示不同成熟階段葡萄所釀酒中反式白藜蘆醇含量范圍為0.5～2.7mg/L，這與其他相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道含量一致[24]，且隨著葡萄成熟度的提高其酒中含量不斷升高。

表6 不同成熟階段葡萄酒中黃酮醇及芪類(lèi)物質(zhì)含量(mg/L)

2.2.3 葡萄酒中對(duì)羥基苯甲酸物質(zhì)含量

不同成熟階段葡萄所釀葡萄酒中對(duì)羥基苯甲酸物質(zhì)含量變化如表7所示，巨峰葡萄酒中四種對(duì)羥基苯甲酸物質(zhì)中沒(méi)食子酸含量最高，是主要的對(duì)羥基苯甲酸物質(zhì)，這也與Fanzone等[25]報(bào)道歐亞葡萄品種中沒(méi)食子酸是最要的單體酚類(lèi)結(jié)果相符，其在葡萄酒中的含量隨著葡萄成熟度的提高而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這也與總酚含量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)吻合，巨峰葡萄酒中龍膽酸含量變化趨勢(shì)與沒(méi)食子酸一致；巨峰葡萄酒中香草酸含量與沒(méi)食子酸、龍膽酸含量變化趨勢(shì)相反，隨著巨峰葡萄成熟度的提高其所釀酒中香草酸含量不斷降低，葡萄S1成熟期香草酸含量最高達(dá)到了2.7mg/L，S5成熟期香草酸含量最低為1.2mg/L；S1、S2葡萄成熟期葡萄酒中未檢測(cè)到水楊酸，且隨著葡萄成熟度提高其葡萄酒中水楊酸含量變化不明顯。

表7 不同成熟階段葡萄酒中對(duì)羥基苯甲酸物質(zhì)含量(mg/L)

2.2.4 葡萄酒中對(duì)羥基肉桂酸物質(zhì)含量

不同成熟階段葡萄所釀葡萄酒中對(duì)羥基肉桂酸物質(zhì)含量變化如表8所示，其中綠原酸與咖啡酸含量最高，是巨峰葡萄酒中主要的對(duì)羥基肉桂酸類(lèi)物質(zhì)，綠原酸含量范圍為8.5～12.4mg/L；咖啡酸含量范圍為6.2～9.3mg/L，且隨著葡萄成熟度的提高，葡萄酒中兩種酚類(lèi)物質(zhì)含量呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，而其他兩種酚類(lèi)物質(zhì)(對(duì)香豆酸、阿魏酸)變化趨勢(shì)與之相反。

表8 不同成熟階段葡萄酒中對(duì)羥基肉桂酸物質(zhì)含量(mg/L)

2.3 不同成熟階段葡萄所釀葡萄酒抗氧化活性的變化

不同成熟期葡萄所釀葡萄酒抗氧化能力如表9所示，為直觀分析不同成熟度葡萄對(duì)其所釀葡萄酒抗氧化能力的影響，以DPPH自由基清除能力、鐵離子還原能力評(píng)價(jià)葡萄酒抗氧化能力，兩種評(píng)價(jià)方式廣泛應(yīng)用于葡萄酒的抗氧化能力評(píng)價(jià)。相關(guān)報(bào)道表明葡萄酒中酚類(lèi)物質(zhì)含量與其抗氧化能力顯著相關(guān)[26-27]，由表9結(jié)果顯示不同成熟度巨峰葡萄所釀葡萄酒皆顯示出較強(qiáng)的抗氧化能力且抗氧化活性差異顯著，不同成熟階段葡萄酒的DPPH自由基清除能力值為1.15～1.54mM TE/L；鐵離子還原能力為663.2～991.3mM AAE/L，低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)告的美樂(lè)、赤霞珠和康貝爾所釀葡萄酒的抗氧化能力[28]，原因?yàn)槠咸哑贩N不同其抗氧化能力存在顯著差異。隨著巨峰葡萄成熟度的提高，無(wú)論是DPPH清除自由基能力還是鐵離子還原能力皆顯示升高趨勢(shì)，這也與總酚含量變化趨勢(shì)一致，S5成熟期巨峰葡萄所釀葡萄酒抗氧化能力最強(qiáng)，出現(xiàn)這一現(xiàn)象的主要原因可能是葡萄成熟度越高其抗氧化能力越強(qiáng)，諸多對(duì)于水果品質(zhì)的相關(guān)研究也證實(shí)了這一點(diǎn)[13,29-30]。

表9 不同成熟階段葡萄酒抗氧化活性

3 結(jié)論

研究以成熟巨峰葡萄(果皮全紫)為材料，將其置于不同濃度氯化鈉溶液中并根據(jù)其密度不同進(jìn)行分級(jí)，將分級(jí)后巨峰葡萄進(jìn)行發(fā)酵，探究不同成熟度葡萄所釀葡萄酒其總酚、總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷、單體酚類(lèi)物質(zhì)含量及抗氧化活性的差異，經(jīng)比較分析得知：隨著葡萄果實(shí)密度的提高，所釀葡萄酒中總酚、總黃酮、總黃烷-3-醇、總花色苷含量呈上升趨勢(shì)，總酚含量的變化范圍為1624.4～1927.5mg/L，總黃酮含量的變化范圍為1155.4～1442.1mg/L，總黃烷-3-醇含量變化范圍為445.5～662.3mg/L，總花色苷含量變化范圍為54.1～98.2mg/L。不同密度巨峰葡萄所釀酒中共檢測(cè)出15種單體酚類(lèi)物質(zhì)(4種黃烷-3-醇，2種黃酮醇，4種對(duì)羥基苯甲酸，4種對(duì)羥基肉桂酸，1種芪類(lèi))，其中沒(méi)食子酸、兒茶素、表兒茶素含量最高是其最主要的酚類(lèi)物質(zhì)。

不同密度的巨峰葡萄所釀葡萄酒皆顯示出較高的抗氧化能力，且隨著葡萄密度的提高其抗氧化能力提高，S5成熟期葡萄所釀葡萄酒的DPPH自由基清除能力、總還原力最強(qiáng)(DPPH自由基清除能力為1.54mM TE/L，總還原力為991.3mM AAE/L)，因此選擇高密度的巨峰葡萄作為釀酒原材料較為合適。