直腸癌新輔助放化療反應(yīng)的預(yù)測性分子標志物研究進展

黃棟 杜金林

根據(jù)2014年中國惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析統(tǒng)計，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率（27.08%）位于第三，死亡率（13.13%）位于第五［1］。直腸癌發(fā)病率約占結(jié)直腸癌總發(fā)病率的1/2，且以中低位直腸癌為主，中晚期直腸癌居多［2］。目前局部進展期直腸癌的標準治療方案是新輔助放化療后的根治性手術(shù)。

雖然新輔助放化療可以提高中低位直腸癌的可切除性，但不同患者新輔助放化療治療的結(jié)果從完全緩解到無腫瘤退行不等，因此，在新輔助放化療前確定那些對新輔助放化療治療不敏感的患者至關(guān)重要，而在新輔助治療之前確定預(yù)測性的分子生物標志物，對那些對新輔助放化療治療不敏感的患者極為重要。

生物標志物的定義是“作為正常生物過程、致病過程或?qū)χ委煾深A(yù)的藥理學(xué)反應(yīng)的指標而被客觀測量和評估的特征”。理想的生物標志物應(yīng)具有足夠的敏感性、特異性，并與疾病的嚴重程度相關(guān)。關(guān)于新輔助放化療療效的評估，文獻中多以TRG分級系統(tǒng)進行評估，在臨床實踐中最常見的四種 TRG 分級系統(tǒng)是由 Mandard 等［3］，Dworak等［4］，Wheeler等［5］和Ryan等［6］（表1）提出的。在這篇綜述中，我們總結(jié)了近年來基于組織和血液的分子生物標志物研究在預(yù)測直腸癌新輔助放化療反應(yīng)方面的進展。包括研究生物標志物與新輔助放化療反應(yīng)以及長期預(yù)后（如OS和DFS）之間的關(guān)聯(lián)。

表1 最常用的腫瘤退化分級（tumor regression grade，TRG）系統(tǒng)

一、血液中的生物標記物

1.蛋白質(zhì)和代謝物

癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是CRC中被廣泛認可的預(yù)后和疾病監(jiān)測的生物標志物，CEA與新輔助放化療療效的關(guān)系已被深入研究。雖然一半以上的研究使用5 ng/mL作為CEA的截斷值，但尚未有CEA升高的有效截斷值具有足夠的敏感性和特異性。有研究將新輔助放化療前血清CEA濃度≤5.33 ng/mL作為預(yù)測直腸癌新輔助放化療敏感的指標［7］。Song等［8］研究了674例接受新輔助放化療治療的局部進展期直腸癌患者的資料，發(fā)現(xiàn)新輔助放化療后CEA水平、新輔助放化療前后CEA比值與腫瘤降期顯著相關(guān)。Dudani等［9］的研究發(fā)現(xiàn)新輔助放化療前CEA升高是無病生存期（disease-free survival，DFS），短期總生存期（overall survival，OS）和病理完全緩解（pathologic complete response，pCR）的獨立預(yù)測因子。

端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（telomerase reverse transcriptase，TERT）是端粒酶復(fù)合物的催化蛋白，利用端粒酶內(nèi)部RNA模板（TR）合成新端粒序列，延長真核染色體末端的端粒，從而防止細胞衰老和死亡。Rampazzo等［10］的研究表明TERT水平的低表達以及新輔助放化療前后的TERT水平差異與新輔助放化療治療反應(yīng)相關(guān)。

2.循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTCs）

CTCs是一種實時的生物標志物，在預(yù)測及篩選對新輔助放化療治療敏感或抵抗的患者方面表現(xiàn)出良好的前景［11］。多項研究發(fā)現(xiàn)，對新輔助放化療敏感者在新輔助放化療后采集的血樣中的CTCs相對于不敏感者顯著下降［11-13］。

3.宿主免疫反應(yīng)

近年來，越來越多的證據(jù)表明，在腎細胞癌、肝細胞癌、胃癌和食管癌等實體腫瘤中，局部和全身炎癥反應(yīng)與不良預(yù)后相關(guān)。這種與腫瘤相關(guān)的炎癥反應(yīng)可以通過血液學(xué)參數(shù)反映出來。其中，中性粒細胞與淋巴細胞的比值（NLR）升高的被證明是pCR較差的預(yù)測因子［14-15］。也有多項研究表明新輔助放化療前的高水平白細胞計數(shù)與較差的治療反應(yīng)相關(guān)。Xiao等［16］則發(fā)現(xiàn)腫瘤浸潤細胞（tumor infiltrating lymphocyte，TIL）和淋巴細胞比率（lymphocyte ratio，LYMR）是pCR的獨立預(yù)測因子。

4.血管內(nèi)生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）

VEGF在腫瘤放療的微環(huán)境中有重要作用。Yu等［17］測定了31例局部進展中至低位直腸癌患者在接受新輔助放化療前的腫瘤標本的5個生物標志物（VEGF，PD-L1，DAXX，p-STAT3，EGFR）與新輔助放化療敏感性的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn)只有VEGF表現(xiàn)為顯著的獨立預(yù)測因子。

5.血小板計數(shù)

在臨床觀察中，我們會發(fā)現(xiàn)不同類型的腫瘤中，血小板增高常與不良預(yù)后相關(guān)。Belluco等［18］將血小板計數(shù)300×109/L作為截斷值進行研究。發(fā)現(xiàn)在接受新輔助放化療治療的直腸癌患者中，治療前高的血小板計數(shù)是一個消極的預(yù)后因素。但是目前仍然很難定義一個最佳的血小板計數(shù)截斷值。

6.循環(huán)腫瘤基因（ctDNA）

循環(huán)腫瘤基因是腫瘤細胞體細胞DNA經(jīng)脫落或者當細胞凋亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，是一種特征性的腫瘤生物標記，是一種可以準確反映腫瘤負荷的實時監(jiān)測指標。Zhou等［19］發(fā)現(xiàn)ctDNA突變的中位變異等位基因頻率（variant allele frequency，VAF）是無轉(zhuǎn)移生存期的強獨立預(yù)測因子。

7.FOX轉(zhuǎn)錄因子家族

FOX蛋白是一類從酵母到人類都廣泛存在的轉(zhuǎn)錄因子。FOX家族蛋白功能涉及胚胎發(fā)育、細胞周期調(diào)控、糖類、脂類代謝、生物老化及免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程，其突變和表達異常與發(fā)育畸形代謝性疾病以及腫瘤發(fā)生有關(guān)［20］。Zhang等［21］通過數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)FOXK1和FOXK2的過表達與新輔助放化療后較差的預(yù)后相關(guān)。

二、腫瘤組織中的分子生物標記物

1.DNA突變和DNA甲基化

目前有許多研究人員將基因型生物標志物作為新輔助放化療pCR的潛在預(yù)測因子。一項研究發(fā)現(xiàn)對新輔助放化療反應(yīng)差的直腸癌相對與有良好反應(yīng)的直腸癌更容易同時發(fā)生KRAS和TP53突變（KP基因型）［22］。Wan等［23］發(fā)現(xiàn)8號染色體≥5個拷貝和CTCs中ARID1A，HDAC1，APC，ERBB3，TP53，AMER1，AR的8個非同義突變與pCR相關(guān)。

DNA甲基化被認為是參與調(diào)控基因表達的重要表觀遺傳機制，并且基于DNA甲基化的生物標記物被認為是用于癌癥診斷和預(yù)后的有用工具。Canto等［24］對直腸癌和正常組織樣本進行全基因組DNA甲基化分析發(fā)現(xiàn)完全病理緩解患者腫瘤中高甲基化探針相對于不完全病理緩解的患者比例較高。

2.MicroRNA

MicroRNA（miRNA）是一種高度保守的小的非編碼RNA，長度為18～25個核苷酸，參與基因的表達后調(diào)控。Machackova等［25］發(fā)現(xiàn)miR-487a-3p與不完全緩解密切相關(guān)。Cristóbal等［26］證明mir-199b的表達與新輔助放化療療效有關(guān)。Du等［27］研究發(fā)現(xiàn)miR-548c-5p、miR-548d-5p和miR-663a與新輔助放化療后的完全緩解顯著相關(guān)。Campayo等［28］發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-99b和miR-375組合可預(yù)測新輔助放化療后的完全緩解與否。

3.長鏈非編碼RNA（lncRNA）

lncRNA是長度為＞200個堿基對的RNA，在基因表達、蛋白表達和染色質(zhì)狀態(tài)等多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。Yokoyama等［29］的研究提示lncRNA中的H19和UCA1可能參與了對5-FU的易感性，進而與對新輔助放化療的敏感性相關(guān)。

4.基因表達譜

腫瘤組織的整體基因表達譜有可能識別與新輔助放化療反應(yīng)相關(guān)的基因信號。雖然研究的基因眾多，但目前發(fā)現(xiàn)主要與細胞增殖和凋亡［30-35］、腫瘤轉(zhuǎn)移［30-31］、細胞周期［32］、DNA修復(fù)［33，36］和細胞分化［36-37］相關(guān)（表2）。

表2 基因表達譜對結(jié)直腸癌新輔助放化療敏感性的預(yù)測

5.腫瘤免疫微環(huán)境

激活宿主免疫應(yīng)答在放化療的治療效果中起著重要作用，同時它也可以激活免疫抑制途徑。在腫瘤免疫微環(huán)境的影響因素中，CD8+TIL被研究最多，多數(shù)研究認為新輔助放化療前較高的CD8+TIL與較差的病理反應(yīng)和預(yù)后相關(guān)［22，38-39］。

6.微衛(wèi)星不穩(wěn)定性（microsatellite instability，MSI）

MSI是指由于在DNA復(fù)制時插入或缺失突變引起的微衛(wèi)星序列長度改變的現(xiàn)象，常由錯配修復(fù)（mismatch repair，MMR）功能缺陷引起，與癌癥發(fā)生有關(guān)，可用于癌癥檢測。Hasan等［40］的研究發(fā)現(xiàn)MSI（+）是一個降低病理完全緩解的獨立預(yù)測因子。

7.DNA修復(fù)基因

基因組完整性的維持對正常細胞增殖和存活是至關(guān)重要的。而DNA修復(fù)失敗將會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定和癌癥。因此DNA修復(fù)基因的表達失調(diào)很有可能會產(chǎn)生對新輔助放化療的不良反應(yīng)。Jimenez等［41］的研究提示DNA修復(fù)基因表達差的患者更易產(chǎn)生對新輔助放化療的不良反應(yīng)。

三、單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNPs）

SNPs主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。Peng等［42］發(fā)現(xiàn)SNP中PTEN：rs12569998與對新輔助放化療的反應(yīng)顯著相關(guān)，PTEN雜合子：rs12569998對新輔助放化療的反應(yīng)優(yōu)于野生型基因型，AKT2：rs8100018與5年無病生存率（DFS）相關(guān)。AKT2雜合子：rs8100018患者復(fù)發(fā)風(fēng)險降低，5年無病生存率優(yōu)于野生型基因型患者，但還沒有發(fā)現(xiàn)有SNP與pCR顯著相關(guān)［42］。

四、印戒細胞癌（signet-ring cell carcinoma）

印戒細胞癌是一種含有大量黏液的癌細胞，黏液把細胞核擠向細胞的一側(cè)，其惡性程度高，預(yù)后較差。有研究發(fā)現(xiàn)新輔助放化療前的活檢樣本中的印戒細胞成分與較好的新輔助放化療反應(yīng)顯著相關(guān)，然而，關(guān)于印戒細胞癌對新輔助放化療療效的預(yù)測價值，目前還缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)［43］。

五、小結(jié)與展望

盡管新輔助放化療在直腸癌中的應(yīng)用已十余年，但我們目前仍缺乏在治療前或治療早期區(qū)分對新輔助放化療耐藥患者和敏感患者的能力，從而指導(dǎo)對治療方案的適應(yīng)性修改。雖然目前已經(jīng)提出了許多分子生物標記物作為新輔助放化療反應(yīng)的預(yù)測指標，然而還沒有一個達到臨床標準。而在直腸癌中缺乏預(yù)測新輔助放化療的生物標志物可歸因于分子生物標志物研究方法上的幾個問題。

首先，大多數(shù)研究只評估了一種類型的生物標記物，而沒有評估它們相對于其他標記物的性能，并且它們自身的敏感性和特異性也不夠。因此，有必要比較和整合多種不同的生物標記物（包括臨床病理和影像學(xué)特征），以對比它們之間的性能，從而開發(fā)出一種最佳的、可靠的生物標志物模型，能夠更準確地預(yù)測對新輔助放化療的反應(yīng)的生物標志物模型。

第二，結(jié)直腸癌是一種高度異質(zhì)性的疾病。并且一些研究表明CRC具有較高的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性［44］。基于這些發(fā)現(xiàn)，單一的生物標志物不太可能達到足夠的敏感性和特異性來預(yù)測不同患者對新輔助放化療的敏感性，因此研究生物標記物和腫瘤生物學(xué)之間的聯(lián)系機制，增加生物標記物及其潛在局限性的大量信息，對我們能夠選擇與特定疾病亞型最相關(guān)的分子生物標記物極為重要。

第三，使用不同的TRG系統(tǒng)也可能是研究中的潛在偏差。在本文所述的研究中使用了各種TRG系統(tǒng)。包括Mandard等［3］，Dworak等［4］，Wheeler等［5］和Ryan等［6］提出的四種TRG系統(tǒng)。這些臨床變異性可能會增加統(tǒng)計分析所需的樣本數(shù)量，影響得出明確結(jié)論。因此，今后的研究應(yīng)嚴格設(shè)計有足夠數(shù)量的樣本，遵循相同的新輔助放化療方案和標準化的腫瘤應(yīng)答評價系統(tǒng)。

總之，盡管沒有預(yù)測分子生物標志物對新輔助放化療有足夠的臨床效用，但是整合不同類型的生物標志物包括臨床病理和影像學(xué)特性，以及腫瘤生物學(xué)的聯(lián)系機制的認識或許可以開發(fā)出一種最佳的、可靠的生物標志物模型，能夠更準確地預(yù)測對新輔助放化療的反應(yīng)。