維格列汀通過調控炎癥細胞因子和Nrf2途徑促進糖尿病足潰瘍創(chuàng)面愈合

王曉娟,曹海泉,袁 寧,何明海

(1川北醫(yī)學院第二臨床醫(yī)學院,南充市中心醫(yī)院內分泌科,南充 637000;2南充市中心醫(yī)院重癥醫(yī)學科;3南充市中心醫(yī)院內分泌科;*通訊作者,E-mail:yixueyan2020@163.com)

糖尿病足潰瘍(diabetic foot ulcer,DFU)是糖尿病患者的嚴重并發(fā)癥之一,與神經(jīng)病變、腎病、心肌病變、血管病變、酮癥酸中毒并列[1]。DFU創(chuàng)面愈合過程是一個復雜的、多階段的過程,由于各種復雜性,患者血管生成和再上皮化不足,嚴重炎癥是中性粒細胞浸潤引起的另一個有害因素。此外,DFU是劇烈炎癥的結果[2]。由于糖尿病患者發(fā)生DFU的風險增加,導致生活質量下降,生產(chǎn)力損失,也給醫(yī)療系統(tǒng)帶來了巨大的經(jīng)濟負擔,患有DFU的2型糖尿病患者每年的直接和間接醫(yī)療費用為13 561美元[3]。有證據(jù)表明導致傷口愈合延遲的各種因素包括血糖水平升高、胰島素抵抗增加、血管生成和膠原沉積減少、浸潤反應延遲、傷口部位血液供應受阻、顆粒組織形成減少和血液黏度增加[4]。盡管在過去的幾十年里對DFU的研究取得了巨大的突破,但有效地治療DFU仍然是一個挑戰(zhàn)。有報道指出,維格列汀在治療糖尿病方面具有較好的效果[5],但關于其對DFU創(chuàng)面修復的研究還尚未清晰,由此,本研究擬觀察維格列汀對DFU大鼠創(chuàng)面修復的影響,為其治療DFU提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及分組

成年雌性SD大鼠45只,體質量(210±10)g,購于成都達碩實驗動物有限公司,許可證號:SCXK(川)2019-031。飼養(yǎng)于恒溫(20-25 ℃)、恒濕(50%±5%)環(huán)境中,自然采光,自由飲水。大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為3組:空白組、模型組(糖尿病鼠足潰瘍)、維格列汀組,每組15只。

1.2 主要試劑及設備

維格列汀購自諾華公司(批號:H20160037);IL-1β ELISA試劑盒(貨號:ZC-36391)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號:ZC-36404)和TNF-α ELISA試劑盒(貨號:ZC-37624)購自上海茁彩生物科技有限公司;蘇木素染液(批號:C200301)、伊紅染液(批號:C200403)購自珠海貝索生物技術有限公司。Collagen-Ⅰ(貨號:ab260043)、Keap1(貨號:ab139729)、Nrf2(貨號:ab137550)、TGF-β(貨號:ab215715)、α-SMA(貨號:AF1032)一抗抗體購自英國Abcam公司;過氧化物酶標記羊抗兔IgG(上海晶天生物)、BMJ-A型包埋機購自常州郊區(qū)中威電子儀器廠;SpectraMAX Plus384酶標儀購自美谷分子儀器有限公司;生化自動分析儀(Beckman Coulter Inc.,愛爾蘭)。

1.3 糖尿病足潰瘍大鼠模型的建立及給藥

大鼠自適應喂養(yǎng)1周后,進行模型制備,除空白組外,其余大鼠造模,造模前大鼠禁食12 h,但可飲水,造模大鼠采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)4-6周,大鼠腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ)50 mg/kg誘發(fā)罹患糖尿病,用藥72 h后,自尾靜脈微量采血檢測隨機血糖,當血糖值超過16.7 mmol/L,即為糖尿病大鼠造模成功。隨后造模大鼠用10%戊巴比妥鈉麻醉,于大鼠的足背皮膚,以印章作3 mm×7 mm的矩形標記,切除全層皮膚,75%酒精棉球消毒創(chuàng)面,形成足部皮膚潰瘍大鼠模型[6]。空白組大鼠始終予以標準飼料喂養(yǎng),不進行STZ注射,但進行印章創(chuàng)口手術。大鼠創(chuàng)面造模成功后24 h,空白組和模型組予以等體積生理鹽水灌胃(2 ml/100 g),維格列汀組灌胃維格列汀(57 mg/kg),1次/d。分別連續(xù)給藥3,6,9 d,每組各取5只進行取材,大鼠禁食12 h,用10%戊巴比妥鈉腹腔注射進行麻醉,剪取創(chuàng)面及周圍3 mm組織,將70%的組織迅速置于-20 ℃低溫冰箱保存,30%的組織用4%多聚甲醛溶液固定,待測。

1.4 大鼠創(chuàng)面組織病理學觀察

將4%多聚甲醛溶液固定的創(chuàng)面組織經(jīng)全自動脫水機脫水,包埋,切片,放入蘇木精中染色約10 min,自來水沖洗使切片顏色變藍,1%鹽酸酒精分化數(shù)秒鐘,使細胞核呈紫藍色,1%氨水中數(shù)秒,至返藍,1%伊紅染色3 min左右,脫水,透明,中性樹膠封存,鏡檢觀察組織病理變化。

1.5 生化參數(shù)測定

空腹動物經(jīng)頸靜脈采集血樣,所有大鼠的血糖水平通過數(shù)字血糖儀獲得,采用生化自動分析儀測定血清總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)濃度。

1.6 ELISA法檢測創(chuàng)面組織IL-1β、TNF-α和IL-6含量

取0.1 g創(chuàng)面組織,加入500 μl PBS研磨,12 000g4 ℃離心15 min收集上清液。分別設置空白孔、標準品孔和待測樣品孔,空白孔不加樣品;標準品孔加入配好的標準品50 μl,然后加入辣根過氧化物酶100 μl;待測樣品孔加入樣本50 μl,然后辣根過氧化物酶100 μl,37 ℃溫育60 min。隨后小心揭掉封板膜,棄去液體,甩干,每孔加滿洗滌液,靜置1 min后棄去,如此重復5次。按照ELISA試劑盒說明操作,最后每孔加終止液50 μl,終止反應,在15 min內,450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。繪制標準曲線,根據(jù)樣品的OD值由標準曲線計算相應的濃度。

1.7 Western blot檢測創(chuàng)面組織Nrf2、Keap1、collagen-Ⅰ、TGF-β和α-SMA蛋白表達

取-20 ℃低溫冰箱保存的大鼠創(chuàng)面組織樣本,RIPA裂解液裂解,BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度,樣品煮沸變性后于-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｊ褂玫攘康鞍踪|上樣,選擇10%的SDS-PAGE進行分離,分離后的蛋白質轉移至PVDF膜上,用5%的脫脂奶粉封閉1 h,封閉結束后按照實驗目的結合一抗β-actin(1∶10 000)、Nrf2(1∶2 000)、Keap1(1∶1 000)、collagen-Ⅰ(1∶1 000)、TGF-β(1∶1 000)、α-SMA(1∶1 000),4 ℃孵育過夜后TBST清洗,然后選擇合適的二抗在室溫孵育1 h,TBST清洗,ECL暗室顯色。使用Bio-Rad全功能成像系統(tǒng)采集圖像,Image-ProPlus分析光密度,以β-actin為內參計算各組蛋白質的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 維格列汀對潰瘍創(chuàng)面組織病理學變化的影響

空白組大鼠分別在給藥3,6,9 d真皮內膠原纖維交錯排列,成纖維細胞團狀排列,胞質紅染,皮下脂肪層及肌層結構較清晰可見,細胞核形態(tài)正常。模型組大鼠在給藥后3 d創(chuàng)面組織內表皮、真皮、皮下脂肪層大面積壞死脫落,細胞形態(tài)基本消失;給藥6 d創(chuàng)面組織內表皮中復層扁平上皮層明顯增厚,表面覆有由變性壞死細胞及出血混合而成的痂皮,真皮層大量膠原纖維壞死和皮下脂肪層和肌層壞死;給藥9 d創(chuàng)面組織復層扁平上皮層明顯增厚,毛囊和皮脂腺等皮膚附屬器基本壞死消失,表皮表面覆有由變性壞死細胞及出血混合而成的痂皮,真皮層較多大量膠原纖維壞死,壞死區(qū)域可見較多炎癥細胞浸潤。維格列汀給藥3 d創(chuàng)面組織內表皮中復層扁平上皮層明顯增厚,表皮層細胞壞死,胞核崩解,見表皮表面覆有由變性壞死細胞及出血混合而成的痂皮;給藥6 d表皮層細胞壞死,表皮表面覆有由變性壞死細胞及出血混合而成的痂皮,真皮層較多膠原纖維壞死,出血;給藥9 d真皮層膠原纖維壞死區(qū)域可見淋巴細胞浸潤及纖維細胞增生,亦可見新生毛細血管形成,皮下肌層清晰可見,胞核形態(tài)正常,其他未見明顯病理變化;與模型組9 d相比,病理損傷明顯改變(見圖1)。

A.HE染色(×100) B.HE染色(×400)

2.2 維格列汀對潰瘍創(chuàng)面空腹血糖和血脂水平的影響

與空白組比較,給藥3 d,模型組TC、TG、HDL、LDL和GLU水平均無明顯變化(P>0.05);給藥6,9 d,TC、HDL和LDL明顯升高(P<0.05);與模型組比較,維格列汀給藥6,9 d,HDL和LDL水平明顯降低(P<0.05),而TC、TG和GLU水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05,見表1)。

表1 各組大鼠空腹血糖和血脂水平變化

2.3 維格列汀對潰瘍創(chuàng)面炎癥細胞因子的影響

與空白組比較,給藥3,6,9 d模型組IL-1β、IL-6、TNF-α含量均明顯升高(P<0.05),與模型組比較,給藥9 d維格列汀組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯降低(P<0.05,見圖2)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.4 維格列汀對潰瘍創(chuàng)面Nrf2途徑的影響

與空白組比較,給藥3,6,9 d模型組Nrf2、collagen-Ⅰ、TGF-β、α-SMA蛋白表達均明顯降低,Keap1蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與模型組比較,給藥9 d維格列汀組Nrf2、collagen-Ⅰ和α-SMA蛋白表達明顯升高(P<0.05);給藥6 d,Keap1蛋白表達明顯降低(見圖3)。

與空白組比較,*P<0.05,**P<0.01;與模型組比較,#P<0.05,##P<0.01

3 討論

糖尿病可影響皮膚損傷修復的止血、炎癥、增殖、成熟步驟,導致延遲修復或發(fā)展為慢性傷口,DFU是糖尿病最致命的并發(fā)癥之一,目前臨床上治療DFU的主要措施為降糖、降脂、抑制炎癥反應等,但DFU的現(xiàn)有治療如改善感覺神經(jīng)傳導速度的肌醇,高壓氧治療等促進創(chuàng)面愈合的療效有限[7]。研究證明維格列汀在治療糖尿病方面具有較好的效果,可能是治療DFU的一種有前途的治療選擇[8]。因此,本研究評估維格列汀對糖尿病引起的傷口延遲愈合的潛在作用。在各種動物模型中,STZ誘導的模型重復性較高,可模擬大多數(shù)延遲傷口愈合的臨床病理條件,包括再上皮化、傷口閉合和生長因子形成[9]。研究報道傷口愈合是對創(chuàng)傷組織的一種反應,導致組織完整性的重建,因此,傷口收縮和閉合是開放創(chuàng)面愈合過程中的重要標志,而創(chuàng)面模型的愈合階段在此過程中受到不同程度的影響[10]。與模型組大鼠相比,維格列汀組治療9 d創(chuàng)面膠原纖維排列整齊,成纖維細胞增多,新生血管形成,創(chuàng)面修復良好。研究指出改善創(chuàng)面愈合可以洞察疾病狀況[11]。在本研究中,維格列汀可明顯改善STZ引起的傷口延遲愈合。提示維格列汀能夠促進DFU大鼠創(chuàng)面愈合,可成為治療DFU的潛在藥物。

血液循環(huán)中的葡萄糖動態(tài)平衡是由輸入葡萄糖速率和輸出葡萄糖速率之間的平衡來調節(jié)的。在正常情況下,胰島素抑制外周組織中葡萄糖的排出,但在糖尿病情況下,葡萄糖生成量增加,因此葡萄糖在循環(huán)中的出現(xiàn)超過了葡萄糖的消失,導致高血糖[12]。同樣,在本研究中,空白組大鼠有基礎水平的血糖,相反,DFU大鼠血糖水平升高,而維格列汀對DFU大鼠的血糖具有改善作用。維格列汀的有益作用可以歸因于改善胰島素敏感性,刺激葡萄糖代謝,并有助于將葡萄糖作為糖原儲存在脂肪細胞中,這種改善與維格列汀治療的DFU大鼠TC、TG和LDL水平的降低相一致,說明維格列汀具有良好的降血脂作用,這一觀察結果與大多數(shù)降血糖藥物具有改善糖尿病脂質代謝異常的潛力是一致的[13]。研究顯示創(chuàng)面愈合作用機制可能有多種,包括促進上皮細胞遷移、加快膠原的成熟和減輕炎癥[14]。在生理條件下,活性氧有利于抵抗微生物的入侵,控制少量的細胞內信號轉導途徑。然而,在糖尿病患者中,高血糖誘導氧化應激,從而使傷口愈合過程停止在不受調控的炎癥階段[15]。核相關因子2(Nrf2)是細胞防御機制的一部分,用于應對嚴重的氧化應激。在氧化損傷后,Nrf2從其細胞質抑制因子Keap1中解離出來,與細胞核中編碼抗氧化酶的細胞保護基因結合,以刺激相關靶基因的轉錄,包括collagen-Ⅰ、TGF-β、α-SMA[16]。Sun等[17]也證實Nrf2在糖尿病創(chuàng)傷愈合中起關鍵積極作用。本研究結果顯示,模型組大鼠創(chuàng)面愈合速度較慢,這是因為剝奪Nrf2導致抗氧化防御反應不足,提高了脂質過氧化水平。而在維格列汀治療后,Nrf2被激活,進而通過相關基因collagen-Ⅰ、TGF-β、α-SMA使創(chuàng)面更快地縮小。研究報道[18]炎癥在傷口愈合過程中起著中心作用,血糖水平升高會導致過氧化物產(chǎn)生過多,從而刺激促炎介質的釋放,臨床上糖尿病患者與局部傷口中TNF-α、IL-1β和IL-6水平升高有關。且文獻支持TNF-α和延遲愈合過程之間存在直接聯(lián)系[19]。此外,TNF-α可以抑制TGF-β的激活,從而抑制collagen-Ⅰ的增殖和合成,而IL-6的增加對血管生成有負面影響[20]。在本研究中,我們檢測了局部促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達,結果表明傷口愈合延遲與傷口區(qū)域炎癥反應加重有關,這與前人研究的發(fā)現(xiàn)一致[21]。而維格列汀的應用明顯減少了傷口處的炎性滲入,表明其具有抗炎的潛力。

綜上所述,本研究結果證實了維格列汀對糖尿病創(chuàng)面延遲愈合的潛在作用,維格列汀通過抑制炎癥標志物(TNF-α、IL-6)、激活Nrf2、collagen-Ⅰ、TGF-β、α-SMA發(fā)揮其潛能,促進創(chuàng)面愈合。