異丙酚對腦出血大鼠繼發性腦損傷的影響

郝建紅,張 潔,吳贊情,董補懷,羅振國

(西安交通大學附屬紅會醫院麻醉科,西安 710000;*通訊作者,E-mail:luckyhao722@sina.com)

腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是第二大中風類型,約占所有中風的15%,世界范圍內ICH發病率約為25/100 000,亞洲為50/100 000[1]。腦出血死亡率高達40%,并且會遺留不同程度的后遺癥,給個人、家庭和社會帶來沉重負擔[2]。因此,研究腦出血病理生理機制,探索新的治療靶點具有重要意義。腦出血患者有時需要手術治療,必然涉及麻醉用藥。異丙酚是一種靜脈麻醉藥,該藥物具有起效快、誘導平穩、蘇醒快等優點,廣泛應用于外科手術病人的麻醉和重癥監護室病人的鎮靜。目前多項研究證明異丙酚具有腦保護作用[3-5]。本研究旨在觀察異丙酚對腦出血大鼠血腦屏障功能的影響,進一步探討異丙酚腦保護的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SD大鼠45只,年齡約8周,體質量約200 g,購自我院動物實驗中心。將45只SD大鼠于恒溫下飼養,給予自由飲水和攝食,并于術前12 h禁食。所有動物的處置方法均符合動物倫理學的要求。

1.1.2 主要藥物 異丙酚(批號為0912211 XLH09,四川國瑞藥業有限責任公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理 45只SD大鼠隨機分為3組:假手術組、ICH組和異丙酚組,每組15只。ICH組和異丙酚組采用右蒼白球注射膠原酶Ⅶ的方法制備ICH模型:以65 mg/kg劑量的戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠,大鼠麻醉后固定在腦立體定向儀上,以前囟為原點,前0.1 mm,外側3.5 mm,腹側6.0 mm作為穿刺點,進針深度5.5 mm,用10 μl微量注射泵以1 μl/min注入2.5 μl膠原酶Ⅶ,留針10 min后緩慢退針,用骨蠟封閉其骨孔,消毒縫合切口,將大鼠置于籠中觀察,待其麻醉復蘇。假手術組進行同樣的手術,但沒有膠原酶輸注。腦出血誘導4 h后,異丙酚組的大鼠經股靜脈泵注異丙酚1.0 mg/(kg·min),持續1 h。

1.2.2 行為學測試 在ICH誘導后第7天行Corner Test檢查大鼠神經行為功能。將大鼠放置在一個由兩塊30 cm×20 cm×1 cm平板構成的30°的夾角里,讓它們自由地向左或向右轉離這個角落。正常小鼠向左或向右轉身的幾率基本相等,而一側腦損傷的小鼠則以向腦損傷同側(右側)轉身為主[6]。在15次試驗中,每只大鼠右轉的次數被記錄下來。

1.2.3 腦核磁檢查 術后7 d每組取3只大鼠,以65 mg/kg劑量的戊巴比妥腹腔注射麻醉大鼠,行頭部MRI檢查。采用Philips 3.0T archive intera超導MR系統及膝關節相控陣線圈采集圖像。掃描序列:T2WI、FLAIR、DWI(b=0,1 000 s/mm2)。

1.2.4 組織學觀察 MRI檢查后將大鼠在麻醉狀態下開胸,暴露心臟,用10%多聚甲醛固定液灌注。先灌注50 ml,之后用微量靜脈輸液泵滴注100 ml固定液,以出血灶為中心取1.5 cm腦組織進行外固定。經過常規的70%-100%的乙醇梯度脫水、二甲苯透明、石蠟浸透包埋后,做連續切片,切片厚度約為5 μm,貼在多聚賴氨酸防脫片劑處理過的載玻片上。切片常規脫蠟至水,蘇木素-伊紅染色。在光鏡下觀察腦神經元病理形態學改變。

1.2.5 腦組織含水量測定 術后7 d每組取6只大鼠,將大鼠實施安樂死。大鼠安樂死后取右側大腦半球稱重(濕重),然后在100 ℃下干燥24 h,得到干重。Eliot公式計算腦組織含水量(brain water content,BWC),BWC=[(濕質量-干質量)/濕質量]×100%。

1.2.6 血腦屏障完整性評估 術后7 d每組取6只大鼠,應用伊文思藍外滲試驗評估血腦屏障完整性。麻醉后經大鼠尾靜脈注射2%伊文思藍溶液(2 ml/kg),注射2 h后用生理鹽水灌流,迅速取腦,生理鹽水沖洗,濾紙吸取剩余的水分,稱取100 mg右側腦組織,放置于3 ml甲酰胺溶液中,充分勻漿后在37 ℃與甲酰胺孵育24 h,將勻漿液12 000 r/min離心10 min,取200 μl上清液加入96孔板中,于632 nm處測量吸光度值,制作伊文思藍標準曲線,利用標準曲線計算伊文思藍含量。腦組織伊文思藍含量(μg/g)=伊文思藍濃度(mg/L)×甲酰胺體積(ml)/腦組織濕質量(g),從而計算出各組大鼠腦組織中伊文思藍含量。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 行為學測試結果

與假手術組相比,ICH組和異丙酚組大鼠右轉次數增多,異丙酚組大鼠右轉次數較ICH組明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05,見圖1)。

與假手術組比較,*P<0.05;與ICH組比較,#P<0.05

2.2 大鼠腦部MRI檢測結果

ICH組、異丙酚組大鼠腦部MRI可見類圓形低密度影的血腫,及血腫周圍環繞的高密度水腫帶,ICH組較異丙酚組腦水腫范圍大。假手術組未見明顯血腫及水腫帶(見圖2)。

A.假手術組 B.ICH組 C.異丙酚組

2.3 組織學觀察

光鏡下觀察可見假手術組神經元形態規則,白質致密。ICH組和異丙酚組神經元破壞,白質松散不規則,炎性細胞浸潤。異丙酚組損傷改變相對ICH組較輕(見圖3)。

A.假手術組 B.ICH組 C.異丙酚組

2.4 腦組織含水量

與假手術組相比,ICH組和異丙酚組大鼠腦組織含水量增多,異丙酚組大鼠腦組織含水量較ICH組明顯減少,差異有統計學意義(P<0.05,見圖4)。

與假手術組比較,*P<0.05;與ICH組比較,#P<0.05

2.5 腦組織伊文思藍水平

與假手術組相比,ICH組和異丙酚組右側大腦半球伊文思藍水平明顯上升,異丙酚組右側大腦半球伊文思藍水平較ICH組明顯下降,差異有統計學意義(P<0.05,見圖5)。

與假手術組比較,*P<0.05;與ICH組比較,#P<0.05

3 討論

腦出血的損傷可分為兩個連續不可分割的過程,包括原發性腦損傷和繼發性腦損傷[7]。原發性腦損傷,主要發生在ICH后0-4 h,是指ICH后血凝塊對大腦造成的物理損傷,腦出血后幾天內血腫增大,顱內壓升高,壓迫腦部相關區域,導致腦缺血。繼發性腦損傷發生在腦出血后4 h,主要是指原發性腦損傷觸發的血腫和凝血的級聯病理反應[8,9]。

腦水腫是典型的腦出血繼發性腦損傷,其嚴重程度與腦出血患者的臨床預后密切相關[7]。腦出血超急性期出現血腫周圍水腫。水腫量在腦出血后24 h內顯著增加,在3 d內迅速進展。腦水腫的迅速發展可導致顱內壓升高甚至腦疝。

血腦屏障(blood brain barrier,BBB)損傷引起的血管源性腦水腫是腦出血后腦水腫的重要機制之一[10]。腦損傷后血腦屏障的破壞導致腦水腫,進而導致腦細胞凋亡壞死,引起神經功能的破壞,因此在腦損傷后減輕血腦屏障破壞至關重要[11,12]。

血腦屏障是介于血液和腦組織之間的對物質通過有選擇性阻礙作用的動態界面,它有選擇地過濾物質進入腦組織,保持腦組織內環境的基本穩定,對維持中樞神經系統正常生理狀態具有重要的生物學意義[13]。血腦屏障由連續毛細血管內皮及其細胞間的緊密連接、完整的基膜、周細胞以及星形膠質細胞腳板圍成的神經膠質膜構成[14]。其中,內皮是血腦屏障的主要結構,腦血管內皮細胞的數量和通透性在很大程度上決定了血腦屏障的功能[15]。腦損傷后內皮細胞之間的緊密連接被破壞,血腦屏障通透性增加,導致腦組織含水量增加[16]。伊文思藍在正常情況下與血清蛋白結合不能通過血腦屏障,在腦損傷后血腦屏障通透性增高,導致伊文思藍進入腦組織,因此伊文思藍染色被認為是評估血腦屏障通透性和血管源性水腫的一種簡單可靠的方法[17]。本實驗中,腦出血大鼠腦組織含水量和伊文思藍含量增加,腦組織水腫明顯,進一步證實大鼠腦出血后腦血管內皮細胞之間的緊密連接被破壞,血腦屏障通透性增高,出現血腫周圍水腫,引起繼發性腦損傷。

目前,麻醉藥對腦損傷的保護作用已有了大量研究,許多研究證明異丙酚具有潛在的神經保護作用,因此成為一種極具潛力的腦保護藥物而備受國內外學者的高度關注。但是,異丙酚神經保護作用的機制目前尚未完全闡明。文獻報道異丙酚可以抗凋亡、抗氧化、清除體內自由基,降低脂質過氧化物,同時可以抑制谷氨酸受體,降低谷氨酸的釋放,降低細胞外谷氨酸的濃度[18-21]。鑒于血腦屏障損傷引起的血管源性腦水腫在腦出血繼發性腦損傷的重要作用,我們把注意力轉移到異丙酚對腦出血大鼠血腦屏障及繼發性腦損傷的影響。本實驗中,異丙酚注射顯著改善了ICH大鼠的行為和組織學特征,包括減少右轉次數,減少伊文思藍外滲,降低腦含水量,減輕腦組織水腫,證實異丙酚可顯著減輕腦出血大鼠血腦屏障的破壞,減輕腦出血大鼠繼發性腦損傷。

綜上所述,大鼠腦出血后腦血管內皮細胞之間的緊密連接被破壞,血腦屏障通透性增高,出現血腫周圍水腫,引起繼發性腦損傷。異丙酚可降低腦出血大鼠血腦屏障的通透性,減輕腦出血大鼠繼發性腦損傷。我們的研究結果將為今后臨床腦出血后神經元的保護提供新的線索和方法。