沙棘黃酮對輻射損傷小鼠造血系統的保護作用及其機制

衛守喆,劉 偉,楊宏昕

(內蒙古自治區人民醫院藥學處臨床藥學科,呼和浩特 010017;*通訊作者,E-mail:ny1882@163.com)

沙棘是我國蒙藥傳統藥材,沙棘黃酮是沙棘中提取的含有多種黃酮成分的一組化合物。經藥理學研究證實沙棘黃酮具有抗氧化作用,能夠清除體內過多自由基,從而降低自由基損傷產生的不良效應[1]。目前在治療循環、免疫、神經和內分泌等系統疾病方面有廣泛的應用[2]。現階段放射性治療是治療惡性腫瘤的常用方法,但在治療過程中常由于輻射損傷會產生一系列不良反應。有研究報道輻射損傷產生主要由于電離輻射后導致自由基損傷,從而導致機體器官損傷[3]。而且現階段應用的的抗輻射藥物普遍存在治療窗較窄、不良反應多及選擇性不高等問題[4]。因此,亟待開發高效、低毒、臨床使用方便的抗輻射藥物。因而,本實驗擬采用直線加速器對小鼠進行單次全身照射,觀察沙棘黃酮對輻射損傷后小鼠造血調控因子的調節作用,并觀察骨髓單個核細胞(bone marrow mononuclear cells,BMNCs)細胞周期和凋亡率變化,進而探討沙棘黃酮抗輻射損傷機制,為輻射防護劑新藥研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗藥物 沙棘黃酮膠囊,內蒙古宇航人公司,批號160301,臨用前取沙棘黃酮膠囊內容物以1%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配成制備成濃度10 mg/ml的混懸液,現配現用。

1.1.2 實驗動物 健康無特定病原體(SPF級)BALB/c小鼠60只,12-16周齡,體質量18-22 g,購自內蒙古大學實驗動物中心,合格證號:20150001。

1.1.3 實驗主要儀器及試劑 血清粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素(TPO)、白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA檢測試劑盒購自齊一生物科技(上海)有限公司;Annexin Ⅴ-FITC/PI檢測試劑盒、凋亡試劑盒購自上海吉凱基因化學技術有限公司;2300C/D SN416型直線加速器治療機(美國Varian公司);FACS Calibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組及給藥方法 實驗小鼠隨機分為3組:空白對照組、放射對照組和給藥組,每組20只,雌雄各半。空白對照組:假照射,僅灌胃給予等量1%羧甲基纖維素鈉,連續灌胃至造模后14 d。放射對照組:照射造模當天開始灌胃給予等量1%羧甲基纖維素鈉,連續灌胃至造模后14 d。給藥組:照射造模當天開始灌胃給予沙棘黃酮混懸液,每日1次,給藥劑量為20 ml/kg,連續灌胃至造模后14 d。

1.2.2 造模方法 除空白對照組外,取其他兩組受試小鼠依次接受直線加速器單次全身照射(4.0 Gy,3.2 Gy/min,焦點距小鼠約100 cm,照射時間1.25 min)。造模后3 d摘除眼球取血檢測白細胞計數,通過白細胞計數(低于4.0×109g/L)判斷造模成功。空白對照組給予假照射,即不進行照射,只將受試小鼠放置在相同環境下,留置時間相同。

1.2.3 輻射損傷小鼠G-CSF、TPO、IL-1β和TNF-α含量檢測 放射對照組與給藥組受試小鼠分別于造模后3,14 d各取10只,摘除眼球取血后處死,所取血液室溫放置1.5 h,然后放置于2-8 ℃冰箱內至血液凝固,再將樣本進行離心處理,轉速2 600 r/min,離心10 min,取離心后上清液保存備用。檢測時按照試劑盒說明書要求測定血清中各調控因子的含量。

1.2.4 BMNCs制備 實驗小鼠分別于造模成功后第3和14天脫頸處死,取股骨用磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗出骨髓細胞,沖洗液離心后棄去上清液,適量PBS洗滌,形成骨髓細胞懸液。骨髓細胞懸液采用Ficoll-Hypague密度梯度離心法處理后可獲取BMNC懸液。

1.2.5 BMNCs細胞周期檢測 實驗小鼠分別于造模后第3和14天,收集BMNCs懸液100 μl,用4 ℃的70%冰乙醇固定過夜;固定液用磷酸鹽緩沖液洗滌2次,加入100 μl牛胰核糖核酸酶(1 mg/ml),置于恒溫水浴箱(37 ℃)中孵育30 min;加入10 μl碘化丙啶染色液(50 μg/ml),避光反應30 min,后將染色液于流式細胞儀上檢測[5]。

1.2.6 BMNCs細胞凋亡率檢測 實驗小鼠分別于造模后第3和14天收集BMNCs,PBS洗滌2次,用Binding緩沖溶液重懸沉淀;取細胞液100 μl,分別先后加入PI染色液和Annexin Ⅴ-FITC染色液各5 μl;混勻后室溫避光孵育15 min,樣品中加入Binding緩沖溶液100 μl,用雙參數分析法計算出凋亡細胞及凋亡百分率[5]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 沙棘黃酮對輻射損傷小鼠G-CSF、TPO、IL-1β水平影響

造模后3 d,與空白對照組比較,給藥組和放射對照組小鼠的G-CSF、TPO、IL-1β水平均明顯升高(P<0.05);與放射對照組比較,給藥組G-CSF、TPO水平明顯升高(P<0.05),IL-1β水平無差異。造模后14 d,與空白對照組比較,給藥組和放射對照組小鼠的G-CSF、TPO、IL-1β水平均明顯升高(P<0.05);與放射對照組比較,給藥組G-CSF、TPO、IL-1β水平明顯升高(P<0.05)。與造模后3 d比較,放射對照組小鼠的G-CSF、TPO、IL-1β水平均明顯降低(P<0.05),呈現下降趨勢;而給藥組小鼠G-CSF、TPO、IL-1β水平均明顯升高(P<0.05,見表1),呈現上升趨勢。

表1 沙棘黃酮對輻射損傷小鼠G-CSF、TPO、IL-1β水平影響

2.2 沙棘黃酮對輻射損傷后小鼠TNF-α水平影響

與空白對照組比較,造模后3,14d放射對照組和給藥組小鼠TNF-α水平均有明顯升高(P<0.05),且給藥組明顯低于放射對照組(P<0.05)。放射對照組造模后14 d小鼠TNF-α水平高于造模后3 d(P<0.05),給藥組造模后14 d TNF-α水平低于造模后3 d(P<0.05,見表2)。

表2 受試小鼠造模3 d和14 d血清中TNF-α水平變化

2.3 沙棘黃酮對輻射損傷后小鼠BMNCs細胞周期及細胞凋亡率影響

與空白對照組相比,造模后第3和14天放射對照組BMNCs細胞周期檢測G0/G1期細胞比例較高,S期比例減少(均P<0.05);與放射對照組相比,給藥組G0/G1期細胞比例明顯降低,S期細胞比例明顯增高(均P<0.05)。與空白對照組比較,造模后第3和14天放射對照組BMNCs細胞凋亡率有明顯增高(P<0.05),給藥組與放射對照組比較,細胞凋亡率顯著降低(P<0.05,見表3)。

表3 造模后3 d和14 d沙棘黃酮對小鼠BMNCs細胞周期和細胞凋亡率的影響

3 討論

放射治療是治療惡性腫瘤的有效手段,可有效控制腫瘤細胞增殖和分化,但同時也會對正常組織造成輻射損傷,如骨髓抑制及造血系統損傷等。因此,目前亟待解決的問題就是如何減輕放射治療后對造血系統的損傷。大量學者都致力于輻射防護劑的研究,并篩選出一些化學制劑,但存在價格較高及具有毒副作用等缺點。而我國傳統的中草藥及其有效成分已成為抗輻射損傷研究的熱點。目前有研究已證實,輻射后動物組織及血液中發現抗氧化劑含量減少,同時伴有脂質過氧化產物增加[6]。雖然已經證實沙棘黃酮具有良好的抗氧化活性,但是目前對沙棘抗輻射損傷作用的研究較少。

在正常生理情況下,骨髓造血系統細胞增殖、分化及凋亡均受到造血調控因子調節[7]。G-CSF、TPO和IL-1β屬于造血正性調控因子;而TNF-α屬于負性調控因子[8]。當機體遭受輻射損傷時負性調控因子增加明顯,從而打破了體內造血調控因子間的平衡,表現為不同程度的造血功能障礙[9]。本實驗結果顯示,與放射對照組比較,給藥組造模后灌胃給藥3,14 d小鼠G-CSF、TPO水平明顯升高,且造模后給藥14 d小鼠G-CSF、TPO和IL-1β水平明顯高于造模后3 d,此結果提示沙棘黃酮能夠提高輻射損傷后小鼠造血正性調控因子水平,并在一段時間內使正性調控因子保持較高水平。與放射對照組比較,給藥組造模后灌胃給藥3,14 d小鼠TNF-α水平明顯降低,且造模后灌胃干預14 d小鼠TNF-α水平低于造模后3 d,此結果提示沙棘黃酮對于輻射損傷后小鼠造血負性調控因子TNF-α水平具有下調作用,而且可以保持下調趨勢。目前有大量關于細胞周期的研究,細胞周期存在多個關鍵的調控點,其中G1期向S期最容易受到外界干擾[10]。另外,有研究報道表明輻射損傷可誘導細胞凋亡,而細胞凋亡是輻射損傷所致骨髓細胞死亡的主要方式[11]。本實驗結果提示,實驗小鼠經一次性全身照射后BMNCs大多被阻滯于G0/G1期,S期比例明顯降低,BMNCs細胞凋亡率較空白對照組明顯增多;而給藥組與放射對照組對比發現,G0/G1期細胞比例出現了明顯降低,S期細胞比例明顯增高,細胞凋亡率也出現明顯降低。據此我們可以推斷加速BMNCs細胞周期由G0/G1期向S期轉換,減少放射損傷引起的骨髓細胞凋亡是沙棘黃酮產生抗輻射造血損傷作用的途徑,從而起到改善輻射受損后的骨髓造血功能的作用。

總之,本研究結果表明,沙棘黃酮對輻射后小鼠造血調控因子產生調節作用,而且能夠加速BMNCs細胞周期由G0/G1期向S期轉換,減少放射損傷引起的骨髓細胞凋亡。這一結果為沙棘黃酮應用于抗輻射損傷提供了一定的理論依據,也為傳統蒙藥沙棘在抗輻射損傷領域的應用奠定了一定的基礎。