基于SSR標記的鳶尾雜交和誘變育種材料遺傳多樣性分析

周 琳 蔡友銘 張永春 楊柳燕

(上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所/上海市設施園藝技術(shù)重點實驗室， 上海 201403)

鳶尾屬于鳶尾科(Iridaceae)鳶尾屬(IrisL．)多年生草本花卉，因其品種多、花色花型豐富、觀賞價值高、抗逆性強、適應性廣等優(yōu)點，大量用于地被覆蓋、草坪鑲邊、河道邊坡綠化等[1]。在鳶尾眾多類群中，路易斯安那鳶尾(Louisiana iris)作為一類雜種鳶尾，具有花色鮮艷豐富、適應性強、抗寒性強等優(yōu)點，是較好的觀花、觀葉類水體綠化材料，在濕地綠化、河塘湖邊造景、切花市場均具有較大的市場潛力[2-3]。路易斯安那鳶尾原產(chǎn)于美國，我國雖已開展了引種栽培、生長習性調(diào)查、組培快繁體系構(gòu)建、抗性評價、育種等工作，但仍缺乏自主育成的新優(yōu)品系，國內(nèi)市場上大量使用國外品種[2]。近年來，路易斯安那鳶尾育種技術(shù)主要為雜交育種、自交育種和60Co-γ 輻射誘變育種，并開展了雜交和種子萌發(fā)體系的優(yōu)化、種間雜交不親和機理研究、自交及其后代觀賞性狀分離分析、種子最適60Co-γ 誘變劑量篩選等研究工作[2，4-6]。然而，上述已有的報道均主要通過表型鑒定自交、雜交或誘變育種的后代，鮮有利用簡單重復序列標記(simple sequence repeats，SSR)等分子標記對其遺傳多樣性分析的報道，這在一定程度上制約了路易斯安那鳶尾育種的進程。

近年來，為提高路易斯安那鳶尾繁殖效率，已構(gòu)建出不同外植體的組織培養(yǎng)繁殖體系[3，7-8]，為輻射誘變育種的開展提供了較好的基礎。本試驗利用收集的5個路易斯安那鳶尾品種進行雜交育種，并通過60Co-γ射線輻射莖尖誘導的組培苗無性系進行誘變育種，最后通過14 對SSR 引物對40 份鳶尾材料進行遺傳多樣性分析，以期通過SSR 標記加快雜交后代和誘變材料的鑒定，縮短育種周期，使鳶尾新優(yōu)品種能較快地進入市場，并成為園林綠化、庭院美化和專類園建設的重要花卉。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及輻射處理

以上海市農(nóng)業(yè)科學院2016年引進的5 個路易斯安那鳶尾品種(Colorific、Heather Stream、Her Highness、Pegaletta 和Spicy Cayun)為試驗親本材料，種植于上海市農(nóng)業(yè)科學院白鶴基地(31°14′16．56″N，121°05′44．88″E)雙層塑料大棚內(nèi)。參照李丹青等[4]的雜交方法進行5 個路易斯安那鳶尾品種間雜交，雜交后代的種子按照沈云光等[9]的方法處理，獲得雜交后代幼苗，并種植于上述基地。參照祝劍峰等[10]的組培快繁方法，構(gòu)建5 個路易斯安那鳶尾品種的無性系，選擇長勢一致、株高為2～3 cm 的組培苗用于輻射誘變處理。利用上海束能輻照技術(shù)有限公司60Co-γ 射線進行輻射誘變處理，設置2．5、5、10、20 和40 Gy 共5 個劑量，劑量率為1 Gy.min-1。輻射誘變處理后，每30 d 轉(zhuǎn)接至繼代培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件(培養(yǎng)基配方、光照強度和周期、溫濕度)與祝劍峰等[10]的繼代培養(yǎng)條件一致。培養(yǎng)2 個月后，統(tǒng)計不同劑量輻射誘變成活率。以引進的路易斯安那鳶尾種質(zhì)資源、品種間雜交后代和輻射誘變材料為試驗材料(表1)，選取路易斯安那鳶尾種質(zhì)資源和雜交后代幼嫩且無病害葉片，以及輻射誘變材料繼代培養(yǎng)2 個月后的健康無病害葉片，稱重后，凍存于-80℃冰箱用于后續(xù)試驗。

表1 供試路易斯安那鳶尾樣本信息Table 1 The sample information of Louisiana iris

1.2 引物序列

從Tang 等[11]基于短莖鳶尾(I.brevicaulis)和暗黃鳶尾(I.fulva)葉片和根系的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)所開發(fā)的532對表達序列標簽(expressed sequence tags， EST)-SSR標記中選擇14 對SSR 標記，引物名稱、正向和反向引物序列、重復基序、擴增長度和退火溫度具體信息見表2，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。

表2 SSR 引物信息Table 2 SSR primer information

1.3 DNA 提取和檢測

使用植物基因組DNA 提取試劑盒(DP305，天根生化科技有限公司)提取5 個路易斯安那鳶尾品種、雜交后代及其誘變材料共40 份材料的葉片總DNA。通過1．0%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 完整性，使用NanoDrop1000 分光光度計(Thermo Fisher Scientific，美國)測定DNA 濃度及純度(A260/A280)后，將符合測試要求的各樣品DNA 均稀釋至10 ng.μL-1，凍存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 SSR-PCR 擴增和毛細管電泳檢測

多重PCR 擴增體系15 μL，包括2×Tsingke Master mix(green)(TSE004， 北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司)7．5 μL、DNA(濃度10 ng.μL-1)1 μL、正反向引物(濃度10 μmol.L-1)各1 μL、ddH2O 4．5 μL。PCR 反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，60 ～64℃退火30 s(不同引物退火溫度見表2)，72℃延伸30 s，共30 個循環(huán)；72℃延伸5 min，最后4℃保存擴增產(chǎn)物。第一次擴增后的產(chǎn)物(2 μL 擴增產(chǎn)物+5 μL 溴酚藍)通過1．0%瓊脂糖凝膠電泳(電壓300 V，12 min)檢測和判斷對應引物是否擴增出目的DNA 片段；隨后進行二次擴增，擴增體系和PCR 反應程序同第一次，第二輪退火溫度為53～57℃(不同引物退火溫度見表2)。基于14 對SSR 標記的40 個路易斯安那鳶尾試驗材料的毛細管電泳檢測委托北京擎科生物科技有限公司完成，具體步驟參照徐曉丹[12]的方法。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用Gene mapper V4．1 軟件(美國Applied Biosystems 公司)分析毛細管電泳檢測的原始數(shù)據(jù)準確位點。根據(jù)峰圖和位點信息判斷檢測引物是否具有位點多態(tài)性，選取特異性高，多態(tài)性好的位點作為后續(xù)分析重點。使用PopGen32 軟件計算SSR 位點遺傳多樣性指標，并計算樣本間的標準遺傳距離[13]；隨后，采用非加權(quán)平均數(shù)法(unweighted pair-group method with arithmetic means， UPGMA)進行遺傳相似性聚類分析，并繪制遺傳親緣關系樹狀聚類圖。參照徐曉丹[12]的方法，通過STRUCTURE version 2．3．4 軟件[14]進行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析；采用的馬爾科夫鏈蒙特卡洛法(markov chain monte carlo，MCMC)方法可預設群體分組(K)，同時根據(jù)等位基因頻率對個體進行計算、抽樣分組，參數(shù)設置參照徐曉丹[12]的方法。隨后利用在線軟件STRUCTURE HARVESTER ( http：/ /taylor0． biology． ucla． edu/structureHarvester/)計算最適K 值[15-16]。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交與誘變育種情況

5 個路易斯安那鳶尾品種花期均在5月中旬至下旬，但當年開花量小且不同品種間花期最大間隔10 d，給雜交工作造成了極大的影響，最終導致品種間雜交收獲的種子數(shù)量較少。5 個品種獲得雜交后代種子的信息見表1，選擇其中長勢較好的9 份種質(zhì)用于后續(xù)分析，9 份種質(zhì)(L3、L4、L5、L16、L17、L26、L34、L35 和L40)的親本信息見表1。

5 個品種經(jīng)不同劑量60Co-γ 射線處理后的組培苗成活率如表3 所示。5 個品種的成活率均隨著輻射劑量的成倍增加而顯著降低，即2．5 Gy 劑量處理時成活率最高，40 Gy 劑量處理時成活率最低。不同品種間2．5 和5 Gy 劑量處理下成活率較為接近，成活率范圍分別為20．77%～24．99%和13．33%～17．89%；10、20和40 Gy 劑量處理時，部分品種間成活率存在極顯著差異(P＜0．01)。參照黃桂丹[17]總結(jié)的經(jīng)驗，即半致死劑量或低于半致死劑量的60Co-γ 對植株傷害小，且易獲得優(yōu)良變異性狀。本試驗中5 個品種在2．5 Gy劑量處理下，成活率均已低于25%，但高于其余4 個劑量處理，因此選擇2．5 Gy 劑量處理后長勢較好的組培苗用于遺傳多樣性分析，誘變材料具體信息見表1。

表3 不同劑量60Co-γ 對鳶尾成活率的影響Table 3 Effect of different doses of 60Co-γ on the survival rate of iris /%

2.2 引物選擇和擴增效果

由于路易斯安那鳶尾由短莖鳶尾、暗黃鳶尾、六角果鳶尾(I. hexagona)、高大鳶尾(I. giganticaerulea)和內(nèi)耳森鳶尾(I.nelsonii)5 個野生種雜交而來[2-3]，因此本試驗從適用于短莖鳶尾和暗黃鳶尾的532 對ESTSSR 標記中選擇了14 對用于遺傳多樣性分析，其中IB179、IB194、IB211、IB282、IB314 和IB318 均位于預測編碼蛋白框(coding DNA sequence， CDS)，與功能基因密切相關。14 對SSR 引物的檢測結(jié)果表明其中10對SSR 引物特異性高且多態(tài)性較好，適用于后續(xù)遺傳多樣性分析；而IB68、IB164、IB174 和IB282 在檢測中存在無多態(tài)性、條帶雜亂或多態(tài)性低等問題，不能用于測試樣本的遺傳多樣性分析。

2.3 SSR 標記多態(tài)性

10 對特異性高且多態(tài)性好的SSR 引物在40 個鳶尾材料中共檢測出60 個等位基因位點(表4)。其中，最小等位基因數(shù)目為4(IB127、IB175 和IB314)，最大等位基因數(shù)目為11(IB168)，平均等位基因數(shù)目為6。有效等位基因總數(shù)為33．087 4，數(shù)值變化范圍為2．091 7(IB175)～4．071 2(IF173)，平均每個位點有效等位基因數(shù)目為3．308 7。香農(nóng)指數(shù)的數(shù)值范圍為0．964 9(IB175) ～1．661 9(IB168)，平均值1．347 2。多態(tài)信息指數(shù)的數(shù)值范圍為0．472 7(IB175)～0．718 5(IF173)，平均值0．637 3，可見10 對SSR 引物具有較高的多態(tài)信息(PIC＞0．25)。觀測雜合度(Ho)和期望雜合度(He)的數(shù)值范圍分別為0．297 3(IF194) ～0．571 4(IB318)和0．529 1(IB175)～0．763 9(IF173)，均值分別為0．451 5 和0．696 2。

2.4 聚類和遺傳結(jié)構(gòu)分析

根據(jù)遺傳相似系數(shù)進行UPGMA 聚類分析，繪制聚類樹狀圖(圖1)。利用10 對SSR 標記可將供試的40 份路易斯安那鳶尾材料相互區(qū)分，10 對SSR 標記可用于鑒定和區(qū)分路易斯安那鳶尾雜交后代和誘變材料。聚類分析將供試材料分成4 類，第Ⅰ類包括9 份材料，為Colorific(L1)、Pegaletta(L27)、Pegaletta 誘變材料(L28～L33)以及♀Pegaletta×♂Heather Stream 雜交后代(L34)；第Ⅱ類包括16 份材料，為Heather Stream(L6)、Heather Stream 誘變材料(L7～L15)及其與其他品種的雜交后代(L3、L4、L5、L16、L17 和L26)；第Ⅲ類包括10 份材料，為Colorific 誘變材料(L2)、Her Highness(L18)、Her Highness 誘變材料(L19 ～L25)以及♀Her Highness×♂Spicy Cayun 雜交后代(L35)；第Ⅳ類包括5份材料，為Spicy Cayun(L36)、Spicy Cayun 誘變材料(L37 ～L39)以及♀Spicy Cayun×♂Colorific(L40)。由此可見，除了Colorific 以外，其余4 個品種的多數(shù)雜交后代(L5、L16、L17、L34、L35 和L40)與母本的遺傳距離較近。Colorific 作為親本時，其雜交后代(L3、L4、L5)均與親本Heather Stream 遺傳距離接近，由于該品種經(jīng)輻射誘變后獲得的誘變材料長勢均較弱，因此僅選擇其中L2 作為測試材料，但L2 與Colorific(L1)遺傳距離較大，且更接近于♀Colorific×♂Heather Stream雜交后代(L3)，可見60Co-γ 射線處理耳促進Colorfic產(chǎn)生變異。5 個路易斯安那鳶尾品種中，Heather Stream 品種獲得的誘變材料長勢較好，選擇了其中9個材料(L7 ～L15)用于測試。由圖1 可知，L7、L13、L14 與親本(L6)遺傳背景較為一致，后續(xù)可不進行繼代培養(yǎng)，而L8～L12 與親本遺傳差異大，值得進一步擴繁后觀測其表型性狀。Her Highness 品種有7 個誘變材料(L19～L25)長勢較好，但僅L23、L24 和L25 存在差異。對于Pegaletta 品種的誘變材料，值得繼續(xù)關注L29 ～L33；對于Spicy Cayun 品種，誘變材料L38 和L39則較為相近。因此，篩選出的10 對SSR 標記能較好地區(qū)分路易斯安那鳶尾親本、雜交后代和誘變材料，可用于路易斯安那鳶尾育種材料的早期篩選。

表4 10 對SSR 引物的多態(tài)性信息含量分析Table 4 The analysis of polymorphic information in 10 SSR primer

在 STRUCTURE HARVESTER 中根據(jù) Evanno等[16]的方法計算，得到的最適ΔK值為5，表明40 個樣品中有5 個基因庫的存在，不同基因庫由不同顏色表示(圖2、圖3)。由圖3 可見，STRUCTURE 結(jié)果將40 份路易斯安那鳶尾材料分為5 個組，且5 個組基本與5 個品種相對應，不同品種的主要基因庫不同，可見基于篩選的10 對SSR 標記分析結(jié)果，5 個路易斯安那鳶尾材料的遺傳結(jié)構(gòu)并不相似。

3 討論

鳶尾屬作為重要園林綠化花卉，國內(nèi)外已通過多種方法開展育種工作，以加快育種進程。雜交育種技術(shù)作為常用育種技術(shù)之一，已用于鳶尾屬種間和品種間育種，主要研究集中于有髯鳶尾類中的德國鳶尾類群和無髯鳶尾類的西伯利亞鳶尾類群、花菖蒲類群等[1，18-19]。我國已開展路易斯安那鳶尾雜交育種相關研究，如報道了黃玉[20]、藍紋白蝶[21]和紫霞等[22]3 個新品種。本試驗利用已收集的5 個路易斯安那鳶尾品種進行雜交育種，對其雜交后代進行遺傳多樣性檢測，發(fā)現(xiàn)多數(shù)雜交后代與母本的遺傳距離更接近。因此，后續(xù)將開展5 個路易斯安那鳶尾品種的性狀調(diào)查、抗性評價、雜交育種等工作，從中篩選符合育種目標的母本，可提高雜交育種效率，縮短育種周期。

圖1 基于SSR 標記的40 個鳶尾材料聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 40 iris samples based on SSR markers

60Co-γ 射線輻射已用于百合、紅掌、玉蘭、菊花等花卉的誘變育種[17]，然而不同物種、不同組織的最佳輻射劑量存在顯著差異，篩選合適的輻射誘變劑量是誘變育種的關鍵步驟之一。鳶尾誘變育種工作相對較少，且主要以種子[2]、種球[23]為誘變材料，篩選出的最佳誘變劑量因材料不同而差異較大。本試驗以不同路易斯安那鳶尾品種的無性系組培苗為試驗材料，不同劑量60Co-γ 誘變處理下，劑量越高其成活率越低，在2．5 Gy 劑量處理下不同路易斯安那品種的成活率均已低于25%。此外，在低劑量輻射劑量(2．5、5 和10 Gy)下，不同路易斯安那品種間成活率差異并不明顯；但隨著劑量增加(20、40 Gy)，Her Highness 和Spicy Cayun 成活率高于另外3 個品種。2．5 Gy 劑量處理下，5 個路易斯安那鳶尾品種間成活率較為接近(范圍為20．77%～24．99%)，但品種間后期長勢存在差異；Colorific、Heather Stream、 Her Highness、 Pegaletta 和Spicy Cayun 分別獲得了1、9、7、6 和3 個長勢健壯的誘變材料，結(jié)合不同60Co-γ 誘變劑量的結(jié)果，可見路易斯安那鳶尾品種間對60Co-γ 射線的耐受能力存在差異，且Heather Stream 品種耐受能力強于其余4 個品種。與鳶尾種子或種球相比[2，23]，鳶尾組培苗適宜的60Co-γ 輻射劑量相對較低，但基于組培快繁體系可獲得大量用于誘變處理的不同品種組培苗，且可對與親本有差異的誘變株系快速擴繁，可加快路易斯安那鳶尾誘變育種進程。

本試驗選擇2．5 Gy 劑量獲得的誘變材料，采用10對SSR 標記分析其遺傳多樣性，其中Heather Stream、Her Highness、Pegaletta 和Spicy Cayun 的誘變材料雖均與其母本遺傳距離較近，但也篩選出多份與親本存在遺傳差異的誘變材料，且發(fā)現(xiàn)5 個路易斯安那鳶尾材料的遺傳結(jié)構(gòu)并不相似，表明路易斯安那鳶尾誘變材料具有豐富的多樣性。值得關注的是， 雖然Colorific(L1)誘變材料中長勢較好的僅為L2，但其與L1 的遺傳距離較大，更接近于Heather Stream，這可能是變異具有不定向性，也可能是由組培的去分化和再分化過程中發(fā)生基因突變等因素引起。雖然，利用10對SSR 標記對獲得的路易斯安那鳶尾材料進行了遺傳多樣性分析，但本研究并未對其后期表型，尤其是花期性狀(可否開花、花色等)、株高、株型等進行觀測，后期將開展表型觀測，篩選與育種目標相符的材料。

圖2 基于STRUCTURE 分析K 值與△K 和LnP(D)值折線圖Fig.2 Lines chart of Kvalue with ΔK value and LnP (D) value based on STRUCTURE analysis

圖3 40 個路易斯安那鳶尾種質(zhì)資源基于模型的遺傳結(jié)構(gòu)(K＝5)Fig.3 Model-based structure of Louisiana iris germplasm resources(K＝5)

近年來，SSR 標記除了用于雜交和自交后代的遺傳多樣性分析和新種質(zhì)鑒定外[24-25]，還成功應用于狼尾草屬牧草[26]、高羊茅[27]、紫花苜蓿[28]等不同物種的誘變材料鑒定。隨著分子標記技術(shù)的不斷發(fā)展，除了傳統(tǒng)SSR 標記開發(fā)方法，基于轉(zhuǎn)錄組或基因組可更高效和大規(guī)模地開發(fā)SSR 標記。例如，在狼尾草屬牧草誘變系鑒定中[26]，Wang 等[29]使用的70 對SSR 引物是基于象草Survey 測序開發(fā)的；蔡璐等[27]從高羊茅基因組SSR 引物庫中隨機選擇了140 對引物用于航天誘變株系的鑒定。與模式植物相比，花卉基因組測序工作相對滯后，且花卉品種(品系)豐富，部分品種(品系)可能尚未有相關轉(zhuǎn)錄組報道。因此，本試驗基于短莖鳶尾和暗黃鳶尾轉(zhuǎn)錄組開發(fā)的532 對EST-SSR標記，選擇其中14 對相對多態(tài)性較高的SSR 引物用于遺傳多樣性分析，其中10 對具有多態(tài)性且穩(wěn)定表達，由此可見這部分標記適用于路易斯安那鳶尾，且可用于雜交后代和誘變材料的鑒定。進一步基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選和驗證多態(tài)性高且穩(wěn)定的SSR 標記，可為路易斯安那鳶尾的遺傳多樣性分析、親緣關系鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建和分子標記輔助育種奠定一定的基礎。

4 結(jié)論

本研究以引進的5 個路易斯安那鳶尾品種為試驗材料，開展了雜交育種和60Co-γ 射線誘變育種，并選擇長勢健壯的幼苗進行遺傳多樣性分析。從短莖鳶尾和暗黃鳶尾的EST-SSR 標記中選擇14 對SSR 標記用于路易斯安那鳶尾品種、雜交后代和誘變材料的遺傳多樣性分析，通過毛細管電泳法篩選出10 對適用于路易斯安那鳶尾的SSR 標記。經(jīng)遺傳多樣性分析，路易斯安那鳶尾雜交后代與母本的遺傳差異小；5 個路易斯安那鳶尾品種經(jīng)不同劑量的60Co-γ 射線輻射后，劑量越高成活率越低；雖然2．5 ～40 Gy 劑量處理下誘變材料成活率均低于25%，但通過EST-SSR 標記分析均獲得了與親本遺傳差異大的誘變材料，可進一步擴繁后對其性狀進行測評。