陸地棉酵母雙雜交cDNA文庫及VdSCP7誘餌載體的構建

韋春艷 秦騰飛 董 娜 李玉青 董 濤 郭 婷 孫家良 王清連

(1 河南科技學院/現代生物育種河南省協同創新中心/河南省棉麥分子生態與種質創新重點實驗室，河南 新鄉 453003； 2新疆農業大學農學院，新疆 烏魯木齊 830000)

棉花黃萎病是一種土傳維管束真菌病害，被稱為棉花的“癌癥”，嚴重影響棉花的產量和品質，對棉花生產造成了巨大的經濟損失[1]。我國棉花黃萎病的主要致病菌為大麗輪枝菌(Verticillium dahlia)[2]。它是一種土傳的半活體營養型絲狀真菌，在世界各地分布廣泛，可以侵染660 多種植物引發黃萎病[3]，導致棉花、芥菜、馬鈴薯、甜菜、向日葵等許多重要經濟作物連年發生病害[4-6]。由于大麗輪枝菌具有寄主范圍廣、類型多、變異快、存活時間久、抗逆性強等特點，致使棉花黃萎病難以防治[7-9]。且陸地棉抗性種質資源匱乏，抗性育種進展緩慢[5]，因此研究棉花和黃萎病菌互作的分子機制，挖掘棉花抗病基因，對提高棉花抗病性具有重要意義。

酵母雙雜交技術是研究蛋白之間互作的有效分子生物學方法[10]，在檢測蛋白之間互作和篩選未知蛋白方面得到了廣泛的應用[11-13]，構建高質量的cDNA 文庫則是運用酵母雙雜交技術的前提。王宇秋等[14]構建了水稻酵母雙雜交cDNA 文庫并利用文庫篩選到了56 個與稻曲病菌效應因子Uv_1261 互作的蛋白。李帥等[15]構建了草莓酵母cDNA 文庫篩選到15 個與草莓鑲脈病毒P6 互作的寄主因子，為明確其互作機理提供了理論依據。甕巧云等[16]篩選擬南芥cDNA 文庫獲得了4 個可能與抗灰霉病基因T1N6-22 互作的蛋白，為闡明其調控的分子機制奠定了基礎。鄭凱等[17]構建了海島棉纖維均一化酵母cDNA 文庫并篩選到了4 個與GbTCP5 互作的蛋白。還有研究者利用酵母雙雜交篩選到了一些參與小麥逆境反應的候選蛋白[18-19]。但是，陸地棉酵母雙雜交cDNA 文庫的構建鮮見報道，近年來國內外學者對黃萎病的研究主要集中于抗病基因鑒定、病害循環、抗性品種培育等方面，并取得了一定的研究進展，但對于黃萎病菌和棉花互作機制的研究較少，棉花抗黃萎病機理還不十分清楚。通過構建棉花酵母雙雜交cDNA 文庫，研究黃萎病菌和棉花互作機理，可為提高棉花抗病性提供理論依據。研究表明，黃萎病菌效應因子可激活植物免疫反應提高植物抗病性[20]，植株的免疫反應程度越強其抗病性也越強[21]。植物受病原體侵染時，可以通過模式識別受體(pattern recognition receptors， PRRs)識別病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)，從而放大先天性免疫，激活第一層防御反應(PAMP triggered immunity， PTI)[22]。病原菌要成功定植必須克服寄主的免疫防衛反應，所以病原菌又分泌效應蛋白進入寄主植物抑制其PTI 反應[23]。一些植物進化出了抗性蛋白能特異性識別病原菌效應因子觸發另一層更強的免疫反應(effector-triggered immunity， ETI)來抑制病原菌的侵染[23-25]。大麗輪枝菌就可以分泌效應蛋白抑制宿主的防衛反應[26]，輪枝菌屬特異的外泌蛋白(VdSCP7)是一種靶向宿主細胞核的大麗輪枝菌效應蛋白，植物在大麗輪枝菌侵染過程中可以識別VdSCP7 并激活ETI 免疫反應，增強抗病性[27]。但是，目前關于VdSCP7 在棉花抗病過程中作用的分子機制尚不清楚。

本研究通過構建棉花cDNA 文庫和誘餌載體pGBKT7-SCP7，從而利用酵母雙雜交系統從棉花cDNA 文庫中篩選與VdSCP7 互作的蛋白，為進一步從分子水平上解析VdSCP7 和棉花互作機理和提高棉花對黃萎病的抗性奠定基礎，也為利用酵母雙雜交系統研究黃萎病菌蛋白特別是病原菌效應因子與棉花互作提供資源。

1 材料與方法

1.1 主要材料

大麗輪枝菌Vd991 菌株由河南省棉麥分子生態與種質創新重點實驗室保存；國審棉花品種百棉1 號由河南科技學院棉花研究所提供，26℃溫室中培養，光照時間為14 h.d-1，相對濕度為60%～70%。

1.2 棉花總RNA 提取及ds cDNA 合成

取馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)上活化培養的大麗輪枝菌菌絲，經完全培養基(complete medium，CM)液體培養基培養后過濾收集孢子，調整孢子濃度為1×107CFU.mL-1，用蘸根法[28]侵染生長2 周左右的棉花幼苗，孢子侵染根部后，分別于3、6、9、12 d 后取樣，將棉花根系樣品混合提取總RNA。具體步驟按照RNAiso Plus Reagent 試劑盒說明書(TaKaRa，日本)進行，1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性后，用Oligotex-dT30＜Super＞mRNA 純化試劑盒(TaKaRa，日本)對mRNA 進行分離純化，具體步驟參照說明書，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA質量。再以含XhoⅠ酶切位點的Oligo(dT)18Anchor Primer 為引物，用SMARTerTMPCR cDNA 合成試劑盒(Clontech，美國)合成cDNA 第一鏈。

以含EcoR Ⅰ酶切位點的SMART (switching mechanism at 5′ end of RNA template)寡核苷酸為引物經long-distance PCR(LD-PCR)合成雙鏈cDNA。雙鏈cDNA 經EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切后，用CHROMA SPIN+TE-1000 (Clontech，美國) 柱純化回收大于500 bp 的雙鏈DNA(double stranded cDNA，ds cDNA)，用于構建棉花cDNA 文庫，具體步驟參照試劑盒說明書進行。

1.3 cDNA 文庫的構建及擴增

將棉花ds cDNA 與pGADT7 質粒載體(Clontech，美國)用酶切連接的方法完成cDNA 文庫的構建。將經EcoR Ⅰ和XhoⅠ酶切處理的pGADT7 載體回收產物與純化回收的ds cDNA 用T4-DNA 連接酶連接。連接體系：7 μL pGADT7、10 μL ds cDNA、1 μL ddH2O、2 μL T4DNA 連接酶，16℃連接20 h。

cDNA 文庫擴增：取連接產物加到大腸肝菌E.coliDH5α Electro-Cells(TaKaRa，日本)中，冰浴10 min 后轉移到電擊杯中，電轉化條件：1．8 kV，200 Ω，25 μF，電轉儀：E.colipulser(美國Bio-Rad 公司)。電擊完成后立即加入1 mL 的SOC(super optimal broth with catabolite repression)液體培養基到轉化產物中，隨后轉移到50 mL SOC 液體培養基中，37℃，250 r.min-1條件下復蘇1 h，然后涂布于LB+Amp 抗性平板上，37℃倒置過夜培養后用LB 液體培養基收集所有菌體，將得到的菌體懸浮液于37℃、250 r.min-1震蕩培養3 h左 右， 用Wizard ? Plus Maxipreps DNA purification System (Promega，美國)提取質粒完成cDNA 文庫的擴增。

1.4 cDNA 文庫質量和滴度檢測

ds cDNA 和pGADT7 連接產物電轉化到大腸桿菌后，取轉化產物2 μL 分別稀釋10 倍、100 倍后涂到LB+Amp 平板上，37℃培養過夜后，統計單克隆數計算原始文庫容量。從平板上隨機挑取32 個單克隆，以pGADT7-F/pGADT7-R 為引物(表1)，通過PCR 擴增，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，鑒定文庫平均插入片段的大小。取1．3 中震蕩培養好的菌液100 μL，按10-2、10-4、10-63 個稀釋度稀釋后分別取100 μL 涂LB+Amp 平板，37℃培養過夜，統計平板上克隆數計算文庫滴度(文庫滴度：克隆數目/稀釋混合物涂板體積×稀釋倍數＝CFU.mL-1)[29]。

1.5 pGBKT7-SCP7 誘餌表達載體構建

根據GenBank 中VdSCP7 基因序列(Gen ID：VDAG_07157)設計帶有EcoR Ⅰ酶切位點的引物SCP7-F 與SCP7-R(表1)。液氮研磨大麗輪枝菌Vd991 菌絲體，用RNA 快速提取試劑盒提取大麗輪枝菌RNA，1%的瓊脂糖電泳檢測后；用反轉錄試劑盒獲得大麗輪枝菌cDNA；純化回收大麗輪枝菌cDNA 后。以Vd991 cDNA 為模板，SCP7-F 與SCP7-R 為引物擴增VdSCP7 基因。

用EcoR Ⅰ酶切并純化回收載體pGBKT7，然后將VdSCP7 的PCR 回收產物用Assembly Mix 重組到pGBKT7 載體上，重組體系：0．5 μL pGBKT7、2 μLVdSCP7、2．5 μL 2×Assembly Mix，然后將重組產物轉化到50 μL Trans1-T1 大腸桿菌感受態細胞中，轉化步驟參考Trans1-T1 Phage Resistant 化學感受態細胞說明書(北京全式金生物技術有限公司)，再提取大腸桿菌中pGBKT7-SCP7 質粒，經EcoR Ⅰ酶切并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，將誘餌載體pGBKT7-SCP7 送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序驗證。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.6 pGBKT7-SCP7 誘餌載體自激活及毒性檢測

參照Clontech 產品說明書，用LiAc 法制備酵母AH109感受態細胞(Clontech，美國)。將5 μL pGBKT7-SCP7 質粒、3 μL pGADT7 質粒、77 μL 無菌水和5 μL 熱變性的Carrier DNA 加入酵母感受態細胞中混勻，再加入PEG/LiAc(240 μL 50%的PEG、36 μL 1 mol.L-1的LiAc)混勻，30℃、200 r.min-1震蕩培養30 min 后，42℃熱激30 min，12 000 r.min-1離心1 min，棄上清，用100 μL 0．9%NaCl 溶液重懸菌體。取適量菌液涂到SD/-Trp/-Leu 和SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu 培養基(TaKaRa，日本)上，30℃培養3 d，觀察結果，分析誘餌載體自激活活性。

將含pGBKT7-SCP7 和pGBKT7 空載體的酵母菌AH109，分別接種于SD/-Trp/Kan 的液體培養基中，30℃、250 r.min-1培養24 h，用722N 型分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)檢測菌液OD600，鑒定誘餌蛋白對細胞的毒性。

2 結果與分析

2.1 棉花總RNA 提取及ds cDNA 的合成

提取被大麗輪枝菌侵染的棉花根系RNA，經測定RNA OD260/OD280為1．91，電泳檢測，28S 和18S rRNA條帶清晰，無拖尾，亮度比接近2 ∶1，說明總RNA 完整性較好，未發生降解(圖1-A)。mRNA 純化后呈彌散狀分布，質量較高(圖1-B)。合成的ds cDNA 于0．2～4．5 kb 之間呈彌散狀，說明不同大小和豐度的mRNA 均有效反轉錄(圖1-C)。ds cDNA 經酶切純化去除小片段后，電泳檢測條帶仍呈彌散狀，片段大小分布在0．5～3．0 kb 之間，純化產物質量較高，可用于構建cDNA 文庫(圖1-D)。

2.2 文庫質量和滴度檢測

將純化后的ds cDNA 連接到pGADT7 載體上，轉入大腸桿菌中，涂布到平板上測定原始文庫庫容量大于2．0×106CFU。從平板上隨機挑取32 個克隆，進行菌液PCR 檢測，部分電泳圖片如圖2 所示，插入的cDNA 片段大小不一，文庫多樣性良好，插入片段平均長度大于1 kb，32 個克隆僅有2 個未檢測到插入片段，重組率約94%。上述結果說明文庫質量較高，可用于后續篩庫試驗。

取擴增后的文庫菌懸液100 μL，按10-2、10-4、10-6稀釋后分別取100 μL 涂LB+Amp 平板，37℃培養過夜，統計平板上克隆數計算文庫滴度，最后得到擴增后的質粒文庫滴度約2．0×109CFU.mL-1，滿足試驗要求所需的滴度。

2.3 誘餌載體(pGBKT7- SCP7)的構建

將測序結果正確的VdSCP7 重組至pGBKT7 載體上，并轉化Trans1-T1 感受態細胞中，將轉化產物涂布于LB+Kan 培養基上。挑取單克隆，搖菌培養，提取質粒，EcoR Ⅰ酶切pGBKT7-SCP7 重組質粒并電泳檢測，切下的目的片段(即圖3 中右圖下方片段)與VdSCP7基因片段(651 bp)大小一致(圖3)，且與生工生物工程(上海)股份有限公司測序結果比對正確，說明誘餌載體pGBKT7-SCP7 構建成功。

圖1 cDNA 文庫的構建Fig.1 Construction of cDNA library

圖2 PCR 檢測cDNA 文庫的插入片段Fig.2 PCR identification of inserts in the cDNA library

圖3 誘餌載體(pGBKT7-SCP7)的構建Fig.3 Construction of bait vector pGBKT7-SCP7

2.4 誘餌載體pGBKT7-SCP7 自激活及毒性鑒定

含有pGBKT7-SCP7 和pGADT7 空載體的轉化菌在SD/-Trp/-Leu 中正常生長(圖4-A)，在SD/-Ade/-His/-Trp/-Leu 中無生長(圖4-B)，說明誘餌載體pGBKT7-SCP7 無自激活活性。含pGBKT7-SCP7 和pGBKT7 空質粒的轉化菌分別在SD/-Trp/Kan 液體培養基培養24 h 后，測定菌液OD600均大于0．8，說明誘餌載體pGBKT7-SCP7 對酵母細胞無毒性，可用于酵母雙雜交系統進行下一步篩庫試驗。

圖4 pGBKT7-SCP7 的自激活驗證Fig.4 Auto-activation identification of pGBKT7-SCP7

3 討論

構建cDNA 文庫是發掘新基因、研究基因功能的重要技術手段。已有研究構建了纖維發育、花發育、鹽旱脅迫等相關的棉花cDNA 文庫，并挖掘到許多與棉花生長發育和抗逆相關的關鍵基因[30]。Zhang 等[31]以海島棉Pima90-53 為材料構建了cDNA 文庫，得到了46 192 條高質量表達序列標簽(expressed sequence tags，ESTs)，獲得了23 126 個unigenes，并發現了1 條新的和植物抗性相關的信號轉導途徑。馬建輝等[32]構建了海島棉cDNA 文庫并篩選到了一系列在棉花花藥發育中起重要作用的基因。Zhang 等[33]利用cDNA文庫鑒定出了一些信號分子、轉錄因子等可能在棉花鹽脅迫應答中起重要作用。張映霞等[34]和Zhang等[35]以黃萎病菌誘導處理后的陸地棉為材料構建cDNA 文庫，得到了一些和抗病相關的基因。但這些棉花cDNA 文庫都不能直接用于酵母雙雜交系統進一步對篩到的關鍵基因進行分子機制的解析。通過構建棉花酵母雙雜交cDNA 文庫，篩選棉花中與黃萎病菌互作的蛋白，解析其互作的分子機理，對提高棉花抗病性至關重要。

酵母雙雜交技術是研究蛋白質之間相互作用的高通量技術，已被廣泛應用，且效率高，篩選量大[36]，而高質量的cDNA 文庫是運用酵母雙雜交系統進行篩選的基礎。本研究以大麗輪枝菌侵染后的棉花根系為材料，誘導抗病相關基因的表達，從而保證構建的文庫基因信息更全面。RNA 質量是構建高質量cDNA 文庫的前提，本試驗中提取的28S 和18S rRNA 條帶清晰，RNA 完整性較好，未發生降解，mRNA 也都被高效的反轉錄了。為提高文庫質量，獲得的雙鏈cDNA 進行過柱純化去除短片段，電泳檢測條帶基本均在0．5 kb以上，說明短片段已去除。通常以重組序列完整性和文庫代表性來評價cDNA 文庫質量[37]，一般的cDNA文庫庫容須達到1×106CFU，文庫滴度須達到1×108CFU.mL-1[29]。本研究構建的cDNA 文庫庫容大于2×106CFU，文庫滴度大于2×109CFU.mL-1，重組率達到了94%，PCR 鑒定文庫插入片段大小不一，多樣性良好，但有個別文庫克隆片段偏小，所能提供的基因信息少，可能需要幾個克隆才能覆蓋一個完整的全基因cDNA。總體來說，本試驗中文庫構建較成功，為后續篩選病原菌中和棉花互作蛋白奠定了基礎。

黃萎病菌基因組編碼700 多種假定調節宿主免疫的分泌蛋白[38]。VdSCP7 是一種新鑒定的大麗輪枝菌分泌蛋白，它定位于植物細胞核，且VdSCP7 誘導的植物免疫反應依賴于其在植物的核定位[39]。植物在真菌侵染過程中可以識別VdSCP7 并激活ETI 反應，增強抗病性，但目前尚不清楚這一過程的分子機制[27]。關于大麗輪枝菌一些效應因子如大麗輪枝菌蛋白激發子(PevD1) 的研究已多見報道[40-42]，但棉花中與VdSCP7 互作蛋白的研究尚鮮見報道，篩選棉花中與VdSCP7 互作的蛋白，將有助于闡明這一作用機制。本研究構建了無自激活活性及毒性的誘餌載體pGBKT7-SCP7 可直接用于下一步酵母雙雜交cDNA文庫的篩選。

4 結論

本研究成功構建了高質量的棉花酵母雙雜交cDNA 文庫和無自激活活性及毒性的誘餌載體pGBKT7-SCP7，為進一步研究VdSCP7 作用機理奠定了基礎。利用本研究構建的棉花cDNA 文庫和酵母雙雜交技術，可以大規模、快速篩選棉花抗病相關基因，為棉花和黃萎病菌互作機制的研究提供資源。