扇脈杓蘭實時熒光定量PCR內參基因的篩選

段國敏 李田園 田 敏 王彩霞 張 瑩

(1中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所，浙江 杭州 311400；2南京林業大學風景園林學院，江蘇 南京 210037)

實時熒光定量 PCR (real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR)是研究基因表達的常用方法，該技術具有耗時短、定量準確、靈敏度高、重復性好、高通量等特點[1-3]，但表達分析的結果經常受不同樣品RNA 提取質量、反轉錄效率等影響。為了消除這些偏差，有必要選擇合適的內參基因進行校正和標準化[4]。理想的內參基因在不同的試驗條件下都會穩定表達，其表達水平與目標基因的表達水平相近[5-7]。在前基因組時代，研究者認為維持生物體生命活動或參與生物體基本代謝的蛋白基因(ACT)、微管蛋白基因(TUB)、多聚泛素酶基因(UBC)和3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(GAPDH)等基因產物，能在不同的細胞中或不同生理狀態下穩定表達，適合作為內參基因[8-10]。然而，根據近幾年的研究表明，在不同的試驗條件下看家基因表達穩定性會有所變化[11-14]。因此，在特定的試驗條件下有必要篩選合適的內參基因。

扇脈杓蘭(Cypripedium japonicum) 為蘭科(Orchidaceae)杓蘭屬(Cypripedium)多年生草本植物，是我國一級保護植物[15]，為東亞地區特有種，其花大色艷，根狀莖可入藥，用于調經、祛風鎮痛等[16]，具有較高的觀賞和藥用價值。扇脈杓蘭種子敗育嚴重，自然狀態下種子萌發率較低，種群生存狀態較差[17-18]。隨著分子生物學的迅速發展，利用分子生物學技術揭示扇脈杓蘭種胚發生的關鍵基因并對其進行開發利用，對推動扇脈杓蘭分子育種具有重要意義，但目前鮮見有關扇脈杓蘭內參基因的研究，可能會影響RTqPCR 基因表達分析的準確性。

為了揭示扇脈杓蘭種子敗育的分子機理，本研究在前期獲得扇脈杓蘭不同發育時期種子的轉錄組數據基礎上，篩選了ACT3、EF1、RPL26B、TIF3I1、SAMDC、CYP22、PP2A3、TUBB3、RPS4、UBC2、UPL1、RAN1 共12 個看家基因作為候選內參基因，并利用geNorm[19]、NormFinder[20]和BestKeeper[21]軟件進行內參基因穩定性分析，旨在找出能夠在扇脈杓蘭不同組織和不同發育階段的種子中穩定表達的內參基因，提高扇脈杓蘭RT-qPCR 表達分析的準確性，同時為其他杓蘭屬植物內參基因的篩選提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為浙江省西天目山國家級自然保護區內海拔1 120 m 處林下的野生扇脈杓蘭，2019年4月對其野生居群進行人工授粉后，分別采取扇脈杓蘭幼根、莖、葉、唇瓣以及5 個不同發育時期的果實(授粉后0、20、40、60、80 d)，用小刀沿果實縱向切開，用刀背將胎座上正在發育的種子迅速刮到凍存管。每個樣品設3次生物學重復，將凍存管中的樣品迅速放入液氮，置于-80℃冰箱備用。

1.2 總RNA 的提取及cDNA 合成

采用DP441 RNAprep Pure 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取各樣品的總RNA，使用Q6000-美國Quawell 超微量可見分光光度計(北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司)進行RNA 濃度和純度的測定，通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 的完整性。將符合要求的RNA 用于cDNA的合成。

根據反轉錄試劑盒NovoStart? Plus All-in-one 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix(上海近岸蛋白科技有限公司)的操作步驟，以各樣品中1 μg 總RNA 為模板，將各樣品的RNA 反轉成cDNA 第一鏈，反應獲得的產物可直接用于PCR 或-20℃儲存備用。

1.3 內參基因的選擇及RT-qPCR 引物的設計

根據本研究前期對扇脈杓蘭不同發育時期種子的轉錄組測序結果，選取ACT3、EF1、RPL26B、TIF3I1、SAMDC、CYP22、PP2A3、TUBB3、RPS4、UBC2、UPL1、RAN1 基因作為候選內參基因。根據RT-qPCR 引物設計原則，利用Primer 3．0 分別對這12 個內參基因進行引物設計。所有引物均由杭州有康生物技術有限公司合成。

1.4 引物特異性檢測

以各個樣品等量混勻的cDNA 為模板進行PCR 擴增。反應體系為25 μL，包括2 ×Taq Master Mix 12．5 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ddH2O 9．5 μL。反應程序：94℃預變性90 s；94℃變性20 s，57℃退火20 s，72℃以每60 s 延伸1 kb，共30 個循環；72℃延伸5 min。用1．5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物的特異性。

1.5 RT-qPCR 及擴增效率檢測

將各樣品的cDNA 等量混勻后，稀釋10 倍作為模板，用上海近岸蛋白科技有限公司的NovoStart?SYBR qPCR SuperMix Plus 熒光定量試劑盒以及實時熒光定量PCR 儀進行RT-qPCR 試驗。反應體系為20 μL，包括2×NovoStart? SYBR qPCR SuperMix Plus 10 μL、上下游引物各1 μL、模板1 μL、ROX 0．4 μL、Rnase Free Water 6．6 μL。按照兩步法進行PCR 擴增，每個樣品3 次技術性重復。擴增程序：95℃預變性1 min；95℃變性20 s，60℃退火30 s，共40 個循環；65～95℃溶解曲線分析。

將等量混勻的cDNA 稀釋成5 個濃度梯度，以10倍稀釋，稀釋后的濃度分別為10-1、100-1、1 000-1、10 000-1、100 000-1，用不同濃度的cDNA 為模板進行RT-qPCR，制作標準曲線，并利用E ＝(10-1/slope-1)×100%計算候選內參基因引物的擴增效率。用R2估測標準曲線回歸方程的可靠程度。

1.6 內參基因的RT-qPCR 擴增與數據處理和分析

用稀釋10 倍的各樣品混合物cDNA 為模板，對12個內參基因進行RT-qPCR 擴增，通過統計各內參基因在不同組織和不同發育時期種子的Ct 值來檢測各內參基 因 的 表 達 量。利 用 geNorm、 NormFinde 和BestKeeper 3 個軟件分別對12 個候選內參基因在扇脈杓蘭不同組織和不同發育時期的種子中表達的穩定性進行分析，篩選表達相對穩定的內參基因。

1.7 內參基因穩定性驗證

為進一步驗證所篩選內參基因的穩定性，在不同發育時期種子中，用穩定性較好的內參基因對2 個目的基因SERK2 和ASK1 進行相對表達量分析。

2 結果與分析

2.1 RNA 樣品質量的檢測

檢測所有樣品RNA 濃度和純度發現，所測樣品的A260/A280 均在2．0 左右。1%瓊脂糖凝膠電泳顯示(圖1)，扇脈杓蘭每個組織的RNA 電泳圖譜清晰，且28S rRNA 比18S rRNA 的亮度高。表明所提取的RNA 純度高、完整性好，可用于后續試驗。

2.2 引物特異性和擴增效率檢測

根據扇脈杓蘭轉錄組的測序結果，在NCBI 對12個候選內參基因以及2 個目的基因的序列進行TBLASTX 分析，結果如表1 所示，這些基因與小蘭嶼蝴蝶蘭[Phalaenopsis equestris(Schauer) Rchb． f．]中相關同源基因有很高的相似性和一致性。如TUBB3 的序列與小蘭嶼蝴蝶蘭同源基因XP_020586417 的相似性高達100%、一致性為98．36%，這些基因中序列相似性最低的是RAN1(71%)，但RAN1 序列一致性最高，達98．84%。其他10 個候選基因與相關基因的相似性、一致性分別為88%～99%、80．43%～97．61%。

表1 扇脈杓蘭候選內參基因和目的基因的比對信息Table 1 Description of candidate reference genes and target gene for RT-qPCR in C. japonicum

以9 份材料等量混勻的cDNA 為模板，進行RTqPCR 分析。1．5%瓊脂糖凝膠電泳結果顯示(圖2)，14個基因的擴增產物條帶單一，與預期結果大小一致，不存在引物二聚體，且候選內參基因引物溶解曲線只有一條主峰，沒有其他雜峰的出現(圖3)，表明引物特異性好。應用標椎曲線法對引物擴增效率的分析如表2 所示，擴增效率為95．07%～108．55%，其中，PP2A3 的擴增效率 最 低(95．07%)，TIF3I1的擴增效率最高(108．55%)，且相關系數R2在0．988 5～0．999 9 之間。

圖2 候選內參基因PCR 擴增產物電泳檢測Fig.2 Electrophoresis of the PCR products of candidate reference genes

2.3 候選內參基因的Ct 值

Ct 值用于候選內參基因穩定性表達分析，由圖4可知12 個候選內參基因Ct 值平均值在20 ～30 之間，其中EF1 的平均Ct 值最小，為23．063 5，平均表達水平最高；UPL1 的平均Ct 值最高，其平均表達水平最低；其他各候選內參基因的平均Ct 值在23．063 5 ～25．378 0 之間，表達水平相差不大。

2.4 內參基因的穩定性分析

2．4．1 geNorm 分析 geNorm 程序是根據計算所得M 值來表示候選內參基因表達穩定性，M 值越小，候選內參基因的穩定性越好[22]。由圖5 可知，在不同試驗條件下，候選內參基因的M 值均在1．5 以下，說明這些基因表達相對穩定，在以全部樣品為研究材料時，UBC2 和UPL1 的M 值最小，表現出最高的穩定性，其次為TUBB3 和TIF3I1，而EF1 的M 值最高，表達穩定性最低。在不同組織樣品中，EF1、RPL26B穩定性較好。當以不同發育時期的種子為研究對象時，TUBB3 和SAMDC的穩定性最佳。不同組織和不同發育時期的種子樣品中穩定性最低的基因分別為SAMDC和ACT3。geNorm 軟件分析結果表明在不同試驗條件下候選內參基因表達的穩定性存在明顯差別。

此外，geNorm 還根據候選內參基因標準化因子的配對差異分析(Vn/n+1)得到內參基因的最佳數目，軟件默認Vn/n+1＝0．15，當Vn/n+1＜0．15 時表明n 個內參基因已經穩定，沒有必要引入第n+1 個基因[22]。如圖6 所示，在以全部樣品為材料時，V4/5＝0．115，表明分析不同組織和發育時期種子需要引入4 個內參基因進行校正，即UBC2、UPL1、TUBB3、TIF3I1。對不同組織進行分析時，V2/3＝0．09，表明內參基因的最佳組合數目為2 個，無需引入第3 個內參基因進行標準化。以不同發育階段種子為對象時，V2/3＝0．138， 2 個內參基因就能夠滿足其標準化。

表2 RT-qPCR 分析中候選內參基因相關參數Table 2 Related parameters of candidate internal reference genes in RT-qPCR analysis

2．4．2 NormFinder 分析 NormFinder 軟件基于組內方差和組間方差，根據候選基因的表達穩定值選出穩定性最好的基因，表達穩定值越小基因越穩定。由表3 可知，TIF3I1 和CYP22 在全部樣品和不同發育時期的種子中表達穩定性最佳，穩定值分別為0．203、0．322 和0．214、0．133。以不同組織為材料時，UBC2和PP2A3 最穩定，穩定值為0．151、0．178。在三組數據中，穩定值最高的基因分別是EF1、SAMDC、ACT3，表明他們的表達穩定性低。其他候選內參基因在NormFinder 軟件中穩定性排名與geNorm 軟件的結果相似。

2．4．3 BestKeeper 分析 BestKeeper 程序通過計算樣品Ct 值的標準差(SD)、變異系數(CV)和基因間相關系數(r)來判斷內參基因的穩定性，相關系數越大、標準差和變異系數越小，表達越穩定[8]。該程序以SD ＝1 為臨界值，當SD＞1 時表明不適合做內參基因，反之則表示基因的表達穩定性好。BestKeeper 軟件只能對10 個內參基因進行比較，因此本試驗基于geNorm、NormFinder 程序對12 個候選內參基因的篩選結果，選取穩定性較好的10 個候選內參基因用于BestKeeper程序分析，結果如表4 所示。CYP22、TUBB3、RPS4、UBC2 在9 個試驗樣品中能夠穩定表達，且CYP22 穩定性最好。在4 個不同組織中內參基因的穩定性從高到低依次為RAN1、PP2A3、CYP22、TIF3I1、RPS4、EF1、UBC2、UPL1、RPL26B。在5 個不同發育時期的種子中UBC2、TUBB3、SAMDC基因最穩定。其他候選內參基因的SD 均大于1，不適合做內參基因。

圖3 候選內參基因PCR 產物的溶解曲線Fig.3 The melting curve of the candidate reference gene

圖4 候選內參基因的Ct 值Fig.4 Raw Ct values for candidate reference genes in all data sets form RT-qPCR

BestKeeper 分析結果與geNorm 和Normfinder 分析結果差異明顯，利用Excel 對3 個軟件分析的穩定內參基因進行幾何平均數的排名(表5)。在全部樣品中內參基因穩定性排序為CYP22、UBC2、TIF3I1、TUBB3；不同組織中基因穩定性從高到低排名為PP2A3、TIF3I1、RAN1、UBC2、RPS4、EF1、RPL26B、UPL1、CYP22；以不同發育時期的種子為材料時，最穩定的內參基因的排序為TUBB3、UBC2、SAMDC。根據geNorm 軟件分析，在全部樣品中最適內參基因為4個，不同組織和發育時期的最適內參基因均為2 個，因此3 組數據最穩定內參基因分別為CYP22、UBC2、TUBB3、RPS4；PP2A3、TIF3I1；TUBB3、UBC2。

2．4．4 內參基因穩定性驗證 以胚胎發生過程中發揮重要作用的SERK2 和ASK1 基因為目的基因，通過在不同發育時期的種子中篩選出的穩定內參基因UBC2 和TUBB3 以及不穩定的ACT3 基因對目的基因進行相對表達量的計算，進一步驗證所篩選的內參基因的穩定性，結果如圖7 所示。以UBC2 和TUBB3 及其組合基因作為內參基因時，ASK1 和SERK2 的相對表達變化趨勢相一致，而以穩定性較差的ACT3 基因作為內參基因時，ASK1 和SERK2 的相對表達發生了改變。由此可知，不合適的內參基因會導致目的基因表達水平有偏差。

3 討論

圖5 利用geNorm 軟件分析內參基因的平均表達穩定值(M)Fig.5 Average expression stability value(M)of reference genes evaluated by geNorm

圖6 通過geNorm 軟件分析內參基因的配對變異值(V)Fig.6 Pairwise variation(Ⅴ)of reference genes generated by geNorm

表3 NormFinder 程序對候選內參基因穩定性的排序Table 3 Candidate reference genes ranked by NormFinder

表4 BestKeeper 程序對候選內參基因的穩定性排序Table 4 Candidate reference genes ranked by BestKeeper

表5 3 種分析軟件的總分排名Table 5 The rank of total score by three analysis software

目前已有關于植物不同組織和發育時期內參基因篩選的研究報道。如張崗等[23]篩選鐵皮石斛(Dendrobium officinaleKimura et Migo)不同組織最適內參基因為EF-1α和18SrRNA。李晗等[24]在羽衣甘藍(Brassica oleraceavar． acephala DC．)的不同組織和不同發育時期柱頭中發現，Tub-α6 在不同組織中穩定表達，在不同發育時期的柱頭中，ACT穩定表達。劉洪峰等[25]在牡丹(Paeonia suffruticosaAndr．)不同發育階段種子和花瓣組織內參基因的篩選中發現，RPS9 和PUF1639 在不同發育階段種子中表達最穩定。本研究中，PP2A3、TIF3I1 基因在不同組織中表達最穩定，以不同發育時期的種子為研究對象時，TUBB3、UBC2基因表達最穩定，這與上述已有研究結果不一致，這可能是由于試驗樣品種類和方法等不同造成的最穩定內參基因的不同。

圖7 ASK1 和SERK2 的相對表達量Fig.7 Relative expression levels of ASK1 and SERK2

根據內參基因在3 個軟件中的綜合排名得出，以全部樣品為材料時，CYP22、UBC2、TIF3I1、RPS4 和TUBB3 表達穩定性最好，PP2A3、TIF3I1 基因在不同組織中表達最穩定；以不同發育時期的種子為研究對象時，TUBB3 和UBC2 基因表達最穩定。由此可見，有必要針對不同的試驗條件和材料選擇不同的內參基因。林榕燕等[26]對“黃金小神童”花器官不同部位和不同雜交蘭(Cymbidium hybrid)品種葉片的研究發現，ChUBQ、ChEF-1α、ChTUB、ChACT及ChUBQ和ChEF-1α基因組合可作為內參基因，這與扇脈杓蘭不同組織的內參基因存在差異，Li 等[27]發現ACT在水稻種子和不同組織中均能穩定表達，馬璐琳等[28]關于西南鳶尾(Iris bulleyanaDykes)和白花變型西南鳶尾(Ⅰ.bulleyanaDykes f．albaY． T． Zhao)花蕾組織的研究發現，最穩定的內參基因為ACT，但其在扇脈杓蘭種子和不同組織中穩定性較差。這說明不同物種和不同組織器官中內參基因不存在通用性。

通過3 個軟件對候選內參基因在全部樣品、不同組織和不同發育時期種子的表達穩定性分析結果得出，候選內參基因在geNorm 和NormFinder 分析軟件中排名相似，但BestKeeper 分析結果與geNorm 和NormFinder 分析結果存在明顯差異，這與蔣婷婷等[29]對石蒜屬(Lycoris)不同組織、不同花發育期和不同雜交種的幼鱗莖進行最適內參基因篩選的分析結果一致，可能是軟件算法不同導致的內參基因排序的不同。如BestKeeper 中排名第2 的TUBB3，在geNorm 和NormFinder 中排名第3 和第6，其穩定值符合內參基因的要求，也可作為內參基因。因此，需要進一步驗證排名靠前內參基因的穩定性。

研究表明，單一內參基因可能對試驗結果有影響，一般選擇2 個或多個基因作為內參基因[30-31]，這有助于調整系統偏差，更有利于得到準確的基因表達定量結果[32]。Park 等[33]對在脅迫作用下的4 種番薯[Ipomoea batatas(L．)Lam．]品種進行候選內參基因的篩選時，使用內參基因ARF、ARF和COX組合以及不穩定內參基因TUB分別對IbLEA14 和swpa2 基因進行表達驗證，結果顯示單個最佳內參ARF與ARF和COX組合的表達水平有微小差異，而以TUB為內參基因的表達水平則呈現相反的結果。本研究對目的基因ASK1、SERK2 在不同發育時期的種子中進行表達分析，發現利用2 個內參基因在單獨定量及其組合定量方面差異較小，表明利用2 個內參基因組合進行基因表達定量分析完全可行。

4 結論

本研究共選取12 個候選內參基因，研究其在扇脈杓蘭不同組織和不同發育時期種子的表達情況，分析了各候選內參基因的穩定性。結果表明，12 個候選內參基因在不同組織和不同發育時期種子中均有表達，但表達量存在差異，在以全部樣品為材料時，CYP22、UBC2、TUBB3、RPS4 表達穩定性好；以不同組織為研究對象時，PP2A3、TIF3I1 表達最穩定；以不同發育時期的種子為材料時，TUBB3、UBC2 表達最穩定。隨著分子生物學的迅速發展，可以借助全基因組測序來探究更多未知且恒定表達的內參基因。本研究結果不僅提高了扇脈杓蘭基因表達分析的準確性，也為其他杓蘭屬植物內參基因的篩選提供了理論參考。