毛竹PheDof2轉錄因子克隆及表達分析

劉 俊 程占超 鄭慧芳 蔡苗苗 彭立鑫 白羽聰 宋華建 高 健

(1 國際竹藤中心/國家林業和草原局竹藤科學與技術重點開放實驗室， 北京 100102；2河南中醫藥大學/中醫藥科學院，河南 鄭州 450046)

Dof 蛋白是植物轉錄因子中的一個主要家族成員，屬于C2C2 單鋅指蛋白超家族，含有一個獨特的半胱氨酸(Cys)殘基的單鋅指保守Dof 結構域。Dof 蛋白由一個拷貝的Dof 保守域和兩個結構域(N 末端高度保守的DNA 結合結構域和C 末端轉錄調控域)組成[1]。Dof 蛋白在許多植物中普遍存在，是植物特有的轉錄調控因子，研究表明，Dof 轉錄因子在植物的生長發育、信號轉導、碳氮代謝、種子萌發、光周期響應、非生物脅迫和激素代謝等多種生物學途徑中都發揮了重要作用[2-5]。在擬南芥中，DAG1 和DAG2 參與種子的萌發[6]，AtDof2．4、AtDof5．8 和AtDof5．6/HCA2 參與維管組織的發育[7]。OsDof24 和OsDof25 能夠調節水稻種子中貯藏蛋白谷蛋白GluB-1 基因的表達[8]。過表達OsDof12 減少轉基因水稻主枝和側枝的數目，導致植株高度降低，葉片直立、縮短，小穗變小[9]。大量研究表明，Dof 轉錄因子參與植物的非生物脅迫等防御反應[10-11]。在擬南芥中，AtDof1．1 基因在茉莉酸甲酯(methyl jasmonate， MeJA)處理后，表達量上調2 ～3倍[12]，AtDOF5．8 通過調控ANAC069 參與鹽脅迫響應[13]。AtCDF3 基因的表達受干旱、鹽、高溫和脫落酸(abscisic acid， ABA)的誘導，過表達CDF3 提高了轉基因擬南芥對干旱、寒冷和滲透脅迫的耐受性，誘導轉基因植株提前開花，但缺失表達CDF3(cdf3-KO)則導致轉基因植株抗性減弱，CDF3 可以調控細胞滲透和活性氧(reactive oxygen species， ROS)穩態相關基因表達，CDF3 通過多跨膜結構蛋白(GIGANTEA，GI)依賴和獨立的方式調節應答植物中糖和氨基酸水平的變化，由此說明，擬南芥CDF3 基因在非生物脅迫中發揮著多重作用[14]。在二穗短柄草中，BdCBF1、BdCBF2和BdCBF3 通過調節下游靶基因DEHYDRIN5．1(Dhn5．1)和COR的表達，在寒冷、干旱和鹽脅迫中發揮重要作用[15]。

廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區的1 250 多種竹子，經常受到環境變化的影響，在進化過程中，竹子已形成多種防御機制以適應復雜的環境[16]。毛竹(Phyllostachys edulis) 禾 本 科(Poaceae) 竹 亞 科(Bambusoideae)剛竹屬(Phyllostachys)，是中國特有的重要經濟竹種[17]。然而，毛竹在生長過程中經常受到環境的脅迫，如干旱、高溫、干冷等，嚴重影響其生長、分布，以及冬筍的質量和產量[18-20]。目前，關于毛竹Dof基因的報道較少，先前研究表明，PheDofs參與毛竹非生物脅迫響應[21-23]，但調控機制尚不清楚。因此，本研究以毛竹cDNA 為材料，從毛竹中克隆得到PheDof2 基因，在生物信息學分析的基礎上，分析該基因在干旱、ABA 處理條件下的表達模式，初步鑒定PheDof2 的功能，旨在為毛竹抗性育種提供候選基因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

毛竹種子采自廣西省桂林市大境縣(110°17′～110°47′E，25°04′～25°48′N)，盆栽于長25 cm、寬15 cm 塑料花盆中。栽培基質為蛭石∶腐殖土∶花園土(1 ∶1 ∶1)，置于光照恒溫培養箱中，培養溫度白天25℃，夜晚18℃，光周期為16 h 光/8 h 暗，相對濕度80%，營養液澆灌培養至3 個月。

TRIZOL、乙醇、氯仿、異丙醇、T4 DNA 連接酶、熒光定量試劑(Promega 公司，美國)；LATaq酶、反轉錄試劑盒(TaKaRa 公司，日本)；膠回收試劑盒(QIAGEN公司，德國)；RNA 小量提取試劑盒(AXYGEN 公司，美國)。

1.2 目的基因克隆

從毛竹基因組數據庫中獲得PheDof2 基因的編碼序列(coding sequence， CDS)，設計特異性引物(表1)，并在引物的上游和下游分別添加KpnⅠ和SalⅠ酶切位點，以毛竹cDNA 為模板，利用特異引物PheDof2-F-Kpn Ⅰ和PheDof2-R-SalⅠ，反轉錄PCR(reverse transcription PCR， RT-PCR)擴增目的基因，經過瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠(ethidium bromide，EB)顯色，通過膠回收，純化目的基因，將純化后的目的片段連接至pGEM-T easy 載體，利用熱激轉化法轉入DH5α 大腸桿菌(Escherichia coli)，通過藍白斑篩選，獲得陽性克隆，菌落經PCR 檢測后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測定序列。

表1 引物信息Table 1 Primers information

1.3 生物信息學分析

采用 Protparam ( http：/ /web． expasy． org/protparam/)在線分析軟件預測PheDof2 蛋白的基本物理化學性質[24]；通過NCBI Conserved Domain Search service 對目的基因的保守結構域進行鑒定，利用Gene Structure Display Server 軟件對基因結構進行分析，用PlantCARE ( http：/ /bioinformatics． psb． ugent． be/webtools/plantcare/html/)軟件對啟動子序列順式作用元件進行分析[25]，通過ClustalX 1．83 進行多序列比對[26]，并使用MEGA 6．0 軟件的鄰接法(neighborjoining，NJ)進行1 000 次重復(＞50%)，構建系統進化樹，分析其進化關系。

1.4 脅迫處理試驗

干旱處理：利用20% 聚乙二醇(polyethy lene glycol， PEG)8000 對3 個月的毛竹實生苗進行澆灌處理，分別取處理后0(對照)、1、3、6、12、24、48、72 h 的根、莖、葉片，于液氮中迅速冷凍，-80℃冷凍保存，用于后續提取RNA。ABA 處理：使用200 μmol.L-1ABA對3 個月的毛竹實生苗進行澆灌處理，在處理后0、0．5、3、6、9、12、24、48、72 h 采集葉片，液氮中迅速冷凍，-80℃冷凍保存，用于后續提取RNA。

1.5 PheDof2 表達水平檢測

利 用 Roche LightCycler480 ? System， SYBR ?Premix EXTaqTMkit(美國Gene Copoeta 公司)進行實時熒光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR， RT-qPCR)反應，20 μL 反應體系：2×mix 10．0 μL、正向引物/反向引物各0．5 μL、cDNA 2．0 μL、ddH2O 7．0 μL。反應程序：95℃預變性5 min；95℃變性10 s，60℃退火10 s，72℃延伸10 s，45 個循環。內參基因為TIP41[27]，使用2-ΔΔCt法[28]對3 次生物學重復的數據進行分析，通過SigmaPlot 12．5 作圖。

從NCBI 的Short Read Arshive (SRA)數據庫中下載毛竹不同高度筍(S1：冬筍；S2：50 cm；S3：100 cm；S4：300 cm；S5：600 cm；S6：900 cm；S7：1 200 cm；CK：成熟莖)和不同花發育時期(CK：未開花葉片；F1：花芽形成期；F2：花序伸長期；F3：盛花期，F4：幼胚形成期)的轉錄組數據[29-30]，不同組織的相對表達豐度用每百萬映射中每個堿基讀取數(read per ktlobase per million mapped read， RPKM)值表示，并對該數值取對數(log2)進行統計分析，基因表達圖譜通過Sigma Plot 12．5 軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 PheDof2 基因克隆載體構建及結構分析

以毛竹cDNA 為模板，PheDof2-F 和PheDof2-R 為引物進行PCR 擴增，發現在1 000～2 000 bp 之間有清晰的條帶(圖1)，測序結果顯示條帶長度為1 614 bp，與毛竹基因組數據庫中完全符合，將其命名為PheDof2。

圖1 毛竹PheDof2 基因片段電泳圖Fig.1 Electrophoresis of the amplification fragment of PheDof2 gene from moso bamboo

通過ProtParam 軟件分析發現，PheDof2 編碼537個氨基酸，蛋白質的分子量為53．20 kDa，等電點為5．37；保守結構域分析表明，PheDof2 含有由56 個氨基酸組成的典型zf-dof 結構，屬于Dof 轉錄因子家族成員。基因結構分析顯示，PheDof2 含有兩個外顯子，一個內含子(圖2)；亞細胞定位預測表明，該基因定位在細胞核中，這與轉錄因子在細胞核中發揮作用的研究結果相一致。

圖2 PheDof2 基因結構分析Fig.2 Gene structure analysis of PheDof2

2.2 PheDof2 啟動子元件分析

為了預測PheDof2 基因的功能以及為可能的調控機制提供參考依據，對PheDof2 基因編碼序列ATG 上游2．0 kb 的啟動子序列進行順勢作用元件分析。Plant CARE 預測結果顯示，該基因啟動子區域不僅含有真核生物典型的順式調控元件及激素調控相關的元件(表2)，還含有28 個其他作用元件，主要參與光應答、非生物脅迫和生長發育等生物學過程。光應答元件數量最多有11 個，如G-Box、G-box、GATA-motif、Sp1和Box 4 等，還含有多個非生物脅迫響應元件、低溫響應相關元件LTR、分生組織(CAT-box)和胚乳(GCN4_motif)[31]表達相關調控元件等(表2)。由此說明，PheDof2 參與多種生物學過程，可能在毛竹非生物脅迫響應和激素調控方面發揮重要作用。

2.3 PheDof2 蛋白進化分析

利用PheDof2 的氨基酸序列，在NCBI 進行序列比對，構建PheDof2 系統進化樹。由圖3 可知，單子葉植物、雙子葉植物、松柏植物和苔蘚植物分別聚為4 個分支，PheDof2 與單子葉植物聚為同一分支，與二穗短柄草的親緣關系最近，同源性為79．05%，與小麥、水稻、高粱、小米的同源性均在70%以上，這與物種的進化結果相一致[32]。多序列比對結果顯示，PheDof2 編碼的氨基酸序列與其他物種Dof 蛋白同源性較高，均含有高度保守的C2C2 單鋅指結構域，即zf-dof 結構域(圖4)，表明PheDof2 屬于Dof 轉錄因子家族成員。

2.4 PheDof2 基因在毛竹不同組織及不同發育階段的表達模式

由圖5 可知，PheDof2 在毛竹的根、莖和葉片中均有表達，但表達水平不同；在葉片中，PheDof2 的表達量最高，其次是根，在莖中的表達水平最低，表明PheDof2的表達具有組織特異性。在不同高度筍中，S1～S2 是毛竹筍的細胞分裂階段，S4～S6 是筍的快速生長階段。由圖6-A 可知，PheDof2 在S1 ～S2 中的表達量較高，表明PheDof2 參與毛竹筍的生長發育，在筍細胞分裂階段發揮主要作用；在毛竹花不同發育時期，PheDof2 在花序伸長期的表達水平最高，且花中的表達水平均高于葉片中的表達水平(圖6-B)，說明PheDof2 參與毛竹花的發育，主要在花序伸長期發揮作用。

表2 Plant CARE 預測PheDof2 啟動子區域順式作用元件基本信息Table 2 Plant CARE predicts the basic information of cis-acting elements of PheDof2 promoter region

圖3 PheDof2 基因編碼蛋白系統進化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis of amino acid sequences encoded by PheDof2

圖4 毛竹PheDof2 與其他植物Dof 氨基酸序列的多重比對Fig.4 The multiple alignment of amino acid sequences of PheDof2 from moso bamboo and other plants

圖5 PheDof2 在毛竹不同組織中的表達分析Fig.5 Expression analysis of PheDof2 in different tissues of moso bamboo

圖6 PheDof2 在毛竹不同組織及不同發育階段的表達分析Fig.6 Expression analysis of PheDof2 in different tissues and developmental stages of moso bamboo

2.5 PheDof2 基因對干旱脅迫和ABA 處理的響應

在PEG8000 干旱處理的根中，PheDof2 呈現先升高后降低，再升高的表達趨勢(圖7-A)，PheDof2 在處理6 h 時，表達豐度達到峰值，是對照的20 倍，隨后表達水平逐漸下降，但仍高于對照組，說明PheDof2 在干旱處理的根中發揮正調控作用。在毛竹的幼莖中(圖7-B)，PheDof2 的表達水平急劇下降，處理1 h 時，PheDof2 的表達水平降為對照0．15 倍，處理24 h 時，降為對照組的0．2 倍，隨后表達水平逐漸上升。在葉片中，PheDof2 在干旱脅迫前期下調表達(圖7-C)，處理6 h 時，PheDof2 的表達水平降為最低值，僅為對照組的0．07 倍，處理24 h，表達水平急劇升高，為對照的1．6 倍。PheDof2 在相同處理的不同組織中具有不同的表達模式，說明PheDof2 在不同組織中可能發揮不同的功能。

在200 μmol.L-1ABA 處理的葉片中，PheDof2 基因的表達水平呈現先降低后升高的表達趨勢(圖8)。ABA 處理6 h 時，PheDof2 的表達水平降為最低值，僅為對照的0．027 倍，隨后表達水平有所上升，在處理48 h 時，PheDof2 的表達水平達到峰值，是對照的1．6倍，由此說明PheDof2 參與ABA 激素調控。

圖7 干旱脅迫處理條件下PheDof2 的表達分析Fig.7 Expression analysis of PheDof2 under drought treatment

圖8 ABA 處理條件下PheDof2 的表達分析Fig.8 Expression analysis of PheDof2 under ABA treatments

3 討論

Dof 蛋白是植物體內特有的一類轉錄因子，參與多種生物學過程，如種子萌發、組織特異性表達、光信號響應、植物激素等。

系統進化分析顯示，PheDof2 與單子葉植物聚為一枝，與二穗短柄草的親緣關系更近，同源性為79．05%，這與物種進化關系相一致[32]，推測PheDof2可能與這些蛋白具有功能相似性。在水稻中，RDD1(rice Dof daily fluctuations1)是PheDof2 的同源基因，RDD1 蛋白主要在維管組織中表達，mRDD1 過表達，增加轉基因植株每穗粒數、二級枝梗數、單株粒數，RDD1 誘導水稻對NH4+、PO43-、K+、Mg+、Cl-等營養離子的有效吸收和積累，提高水稻產量[33]，反義表達RDD1 導致轉基因植株顆粒大小和重量減少，說明該基因與水稻生產力有關[34]，推測PheDof2 可能也參與毛竹種子的形成和發育。在擬南芥中，PheDof2 的同源基因CDF2 可以與DCL1 相互作用，直接與miRNA的某些啟動子結合，影響DCL1 介導的這些原始miRNA 的轉錄進程，說明CDF2 在轉錄和轉錄后水平上調控一系列pri-miRNAs，從而調控植物的發育[35]。推測PheDof2 在毛竹生長發育、miRNA 轉錄方面也可能發揮重要作用，但PheDof2 在毛竹中具體的功能還需進一步驗證。

本研究顯示，PheDof2 在毛竹不同高度筍和不同花發育時期均有表達，主要在筍的細胞分裂期和花發育的花序伸長期表達量較高，由此說明PheDof2 參與毛竹筍的生長和花的發育。在擬南芥中，過表達AtDOF5．4/OBP4 通過促進內循環的早期發生，抑制細胞的擴增，降低了轉基因擬南芥細胞的大小和數目，導致轉基因植株矮小，OBP4 作為一個負調控因子，調節擬南芥細胞的擴張和細胞周期進程[36]；在水稻中，過表達OsDof12 減少轉基因水稻主支和側支的數目，降低植株高度，葉片直立變短，小穗長度變小[9]，推測PheDof2 可能也參與細胞的分裂和植株的生長。Dof不僅參與植物的生長發育，而且參與開花調控，在擬南芥中，AtCDF1 通過與開花誘導因子CO和成花基因FT啟動子結合，抑制CO和FT基因的轉錄，導致轉基因擬南芥開花延遲，在光照條件下，泛素蛋白FKF1(FBOX 1)和多擴膜結構蛋白GIGANTEA(GI)形成GIFKF1 蛋白復合體，抑制AtCDF1 基因的轉錄，進而將AtCDF1 從CO的啟動子區域解除下來，促進開花[37-38]；在水稻中，OsDof12 基因通過直接或間接調節Hd3a和OsMADS14 基因的表達，誘導轉基因水稻開花[39]，推測PheDof2 可能也參與毛竹開花調控。

研究表明，Dof基因參與植物非生物脅迫響應，在擬南芥中，AtDof1．1 在MeJA 處理4 ～6 h 后，表達量升高2 ～3 倍[12]；在番茄中，擬南芥CDFs的同源基因SlCDF1-5 參與干旱、鹽、高溫和冷脅迫的響應[40]，在二穗短柄草中，BdCBF 是冷響應重要的調控因子，誘導一系列脅迫相關基因的表達[15]。在菊花中，CmDofs參與激素和非生物脅迫響應，但表達模式不同[41]。在胡椒中，高溫和鹽處理后，CaDofs呈現先升高后降低的表達趨勢[42]。本研究中，在干旱處理的根中，PheDof2 基因上調表達，發揮正調控作用。ABA 處理中，PheDof2 呈現先降低后升高的趨勢。毛竹中PheDof12-1 基因的表達也受干旱處理的影響，根中PheDof12-1 和PheDof2 基因在處理1 h 時，PheDof12-1 的轉錄水平急劇增加，為對照的70 倍[23]，本研究中PheDof2 相對表達水平是對照的10 倍左右，說明PheDof2 在毛竹干旱處理的根中表達模式與PheDof12-1 基本一致，發揮正調控作用。然而，PheDof4-1 基因的表達受到了強烈的抑制，干旱處理1 h 時PheDof4-1 基因的表達水平迅速降為對照的0．02 倍，隨后繼續降低，說明PheDof4-1 在干旱處理根中發揮負調控作用[21]，與本研究中PheDof2 呈現相反的表達趨勢。由此推測，在干旱處理條件下，PheDof2 和PheDof12-1在毛竹根中可能協同參與脅迫響應。

研究顯示在擬南芥中，AtCDF3 基因的表達受到ABA 處理的誘導[14]，菊花CmDofs基因也參與激素(如ABA、SA 和MeJA)響應[41]。本研究中，ABA 處理6 h 時，毛竹PheDof2 的表達水平降為最低值，為對照的0．027 倍，在處理48 h，表達水平達到最大值，這與PheDof12-1 的表達模式相一致[23]。此外，PheDof2 在毛竹不同組織和不同脅迫處理中呈現不同的表達模式，說明該基因在毛竹不同組織和不同脅迫條件下發揮的作用不盡相同，這可能與基因的組織特異性和組織響應脅迫的先后順序有關。綜上表明，PheDof2 響應毛竹干旱和ABA 處理，具有組織特異性。

4 結論

本研究從毛竹中克隆得到PheDof2 基因，對其理化性質、基因結構、進化關系及順式作用元件進行了分析。結果顯示，PheDof2 基因結構簡單，只含有一個內含子，兩個外顯子，其編碼蛋白與二穗短柄草親緣關系最近，啟動子中含有多個非生物脅迫和光響應元件，PheDof2 在毛竹葉片中表達水平最高。PEG 8000 脅迫和ABA 處理結果表明，PheDof2 可能在毛竹抵御干旱脅迫中發揮重要作用，還可能參與ABA 激素的響應。本研究為探索毛竹Dof基因的功能奠定了一定的理論基礎。