羊棲菜硫酸多糖誘導(dǎo)下的人紅白血病HEL細胞差異表達基因分析

丁浩淼 杜昊霏 付瑞潔 金旭東 謝 策 陳彤妮 汪財生 錢國英

(浙江萬里學(xué)院生物與環(huán)境學(xué)院，浙江 寧波 315100)

白血病是一類造血干細胞惡性克隆性疾病。克隆性白血病因為增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等機制在骨髓和其他造血組織中大量累積，并浸潤其他非造血組織和器官，同時抑制正常造血功能[1-2]。據(jù)報道，我國各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中位居第六位。白血病主要包括急性淋巴細胞白血病、急性髓系白血病、慢性淋巴細胞白血病和慢性髓系白血病4 種類型[3-4]。當(dāng)前白血病常規(guī)療法包括化學(xué)療法、放射療法、靶向療法和骨髓移植等。盡管過去幾十年發(fā)達國家在治療方面取得重大進展，但白血病患者的治療效果仍存在顯著差異[5-7]?；瘜W(xué)療法是一種常見的治療方式，但其會帶來嚴重的不良反應(yīng)且效果較差[8]。且這些不良反應(yīng)與致殘性副作用相關(guān)，如貧血、免疫抑制和脫發(fā)等。因此，對患者來說需要低毒性的新型抗腫瘤藥物。當(dāng)前，已經(jīng)研究了諸多來源于植物、真菌、海洋生物和微生物的天然活性成分，并發(fā)現(xiàn)它們具有抗癌特性。因此可從植物、動物和微生物中發(fā)掘?qū)Π┘毎哂懈吖π覍φ＜毎麩o毒性的新天然產(chǎn)物。在生物活性天然產(chǎn)物領(lǐng)域，當(dāng)前的趨勢是將研究對象轉(zhuǎn)向海洋生物[9]。最近，已發(fā)現(xiàn)源自海藻的化合物與多種健康促進作用有關(guān)，特別是抗氧化、抗炎、抗病毒、抗微生物和抗腫瘤作用[10-11]。多糖作為一種天然的抗腫瘤物質(zhì)，受到越來越多的關(guān)注，多糖的研究工作正逐漸轉(zhuǎn)向腫瘤疾病的預(yù)防和臨床干預(yù)[12]。

羊棲菜(Sargassum fusiforme) 隸屬褐藻門(Phaeophuta) 墨角藻目( Fucales) 馬尾藻科(Sargassaceae)，又名玉草、六角菜、鹿角尖，在我國遼東半島、山東、浙江、福建、廣東淺海域均有分布，日本和韓國也有生長。《神農(nóng)本草》記載羊棲菜可用于治療甲狀腺疾病，其作為食品和藥物已有數(shù)千年的歷史[13-15]。羊棲菜中含有多種對身體有益的生物活性物質(zhì)，如硫酸酯多糖、海藻酸鈉和巖藻黃質(zhì)等[16]。近年來發(fā)現(xiàn)天然來源的多糖具有多種生物活性且毒副作用小，已在生物和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中引起廣泛關(guān)注[17]。羊棲菜硫酸酯多糖是一種含有硫酸基團的天然多糖衍生物，具有多種生物功能，如抗高血脂[18]、抗氧化[19]、免疫增強[20]、降血糖[21]和抗腫瘤[22]。先前研究已經(jīng)報道了羊棲菜的多糖在誘導(dǎo)白血病、胃癌、膀胱癌和乳腺癌細胞凋亡方面的潛力。然而，尚未闡明從羊棲菜中純化的多糖抗腫瘤特性及其潛在細胞和分子機理。

轉(zhuǎn)錄組分析是對基因表達譜的全面認識，為基因組研究、大規(guī)模功能基因和分子標(biāo)記識別提供了一種有效的手段。近年來，轉(zhuǎn)錄組分析已廣泛應(yīng)用于癌細胞研究中，如人肺癌細胞(NCI-H292)[23]、人結(jié)腸腺癌細胞(Caco-2)[24]、小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW 264．7)[25]、人肝癌細胞(HepG2)[26]、人非小細胞肺癌細胞(A549)[27]、 人腎透明細胞癌細胞(Caki-1)[28]和人乳腺癌細胞(MDA-MB-231)[29]。本研究對羊棲菜硫酸多糖( sargassum fusiforme polysaccharide Ⅱ， SFPS Ⅱ) 誘導(dǎo)的人紅白血病(human erytro leukemia cells， HEL)細胞進行了轉(zhuǎn)錄組分析，以期篩選相關(guān)的應(yīng)答基因并分析凋亡相關(guān)信號通路，有利于了解SFPS Ⅱ誘導(dǎo)HEL 細胞凋亡機制，并為利用羊棲菜硫酸多糖預(yù)防和治療白血病提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

RPMI-1640 培養(yǎng)基、高糖DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、抗生素P/S(青霉素10 000 U.mL-1，鏈霉素10 000 μg.mL-1)和胰酶，美國Gibco 公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)和CCK-8，北京索萊寶公司；25 cm2培養(yǎng)瓶、96 孔板和6孔 板， 美國Corning 公 司； TRIzol、 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ，日本TaKaRa 公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

Forma series Ⅱwater jacket 型恒溫CO2培養(yǎng)箱和5417R 高速冷凍離心機，美國Thermo 公司；Heal Force BIOsafe 12 超凈工作臺，上海力申科學(xué)儀器有限公司；Eclipse Ti-S 熒光倒置顯微鏡，日本Nikon 公司；CFX96Touch 熒光定量PCR 系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；SpectraMax190 連續(xù)波長多功能酶標(biāo)儀，美國MD 公司；Agilent 2100 生物分析儀，美國Agilent 公司。

1.3 試驗細胞

人紅白血病細胞(HEL)和人胚肺成纖維細胞(human embryonic lung cells， MRC-5)購自中國科學(xué)院上海細胞庫，HEL 細胞在含10% FBS 的RPMI-1640 培養(yǎng)基中，MRC-5 細胞在含10% FBS 的高糖DMEM 培養(yǎng)基中。

1.4 試驗材料

前期試驗[30-31]分離得到一種羊棲菜硫酸多糖(SFPS Ⅱ)，多糖檢測純度達96%以上且不含蛋白質(zhì)，SFPS Ⅱ紅外光譜表征具有糖類特征結(jié)構(gòu)，且含有硫酸基功能基團，在1 250 cm-1處的峰增強，具有硫酸根S＝O 的對稱伸縮振動，754．6 cm-1和842 cm-1處α-吡喃環(huán)的特征吸收。SFPS Ⅱ采用硫酸鋇比濁法檢測硫酸基含量為26．47%。

1.5 細胞培養(yǎng)

HEL 細胞株復(fù)蘇后，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱，用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基對HEL 細胞進行常規(guī)培養(yǎng)。MRC-5 細胞株復(fù)蘇后，在37℃、5%CO2條件下，用含有10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的高糖DMEM 培養(yǎng)基對MRC-5 細胞進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.6 CCK-8 檢測HEL 細胞增殖抑制作用

取對數(shù)生長期的HEL 細胞，以5×104個.mL-1接種于96 孔板中，每孔加入100 μL 細胞懸液，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加藥10 μL，每個濃度平行5 個復(fù)孔。陰性對照組加入等量無血清無抗生素的RPMI-1640 培養(yǎng)基，試驗組分別加入SFPSⅡ終濃度為10、20、40、60、80、100 μg.mL-1，藥物作用24 h 后，每孔中加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)于培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm 波長處OD值[32]，按照公式計算細胞存活率：

As we are interested to the CRLB of the 2-D central DOAs for the ID sources,we can use the inversion of block matrices to obtain the following expression of CRLB(l):

式中，As： 試驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、SFPS Ⅱ)；Ac：對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、CCK-8、不含SFPS Ⅱ)；Ab：空白孔(不含有細胞和SFPS Ⅱ、含有CCK-8)。

1.7 MTT 檢測MRC-5 細胞增殖抑制作用

取對數(shù)生長期的MRC-5 細胞，以5×104個.mL-1接種于96 孔板中，每孔加入細胞懸液100 μL，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后給藥處理，每孔加藥10 μL，每個濃度平行5 個復(fù)孔。陰性對照組加入等量無血清無抗生素的高糖DMEM 培養(yǎng)基，試驗組分別加入SFPS Ⅱ終濃度為10、20、40、60、80、100 μg.mL-1，藥物作用24 h 后，每孔中加入10 μL MTT(5 mg.mL-1)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸取上清液后加入100 μL無水DMSO，置于搖床上低速避光震蕩15 min，使晶體充分溶解，用酶標(biāo)儀測定570 nm 波長處OD 值，計算細胞存活率：

式中，As： 試驗孔(含有細胞的培養(yǎng)基、MTT、SFPSⅡ)；Ac：對照孔(含有細胞的培養(yǎng)基、MTT、不含SFPSⅡ)；Ab：空白孔(不含有細胞和SFPS Ⅱ、含有MTT)。

1.8 RNA 提取及質(zhì)量檢測

收集SFPS Ⅱ處理和未處理的HEL 細胞用TRIzol試劑按照說明書提取細胞總RNA[33]。1%瓊脂糖凝膠電泳和酶標(biāo)儀鑒定RNA 的純度、濃度及完整性，合格的總RNA 保存于-80℃冰箱待用。

1.9 RNA 文庫構(gòu)建及測序

RNA-Seq 試驗由北京諾禾致源生物信息科技有限公司進行。每個樣本中收集1 μg 總RNA(total RNA)用于RNA-Seq 文庫的制備和測序。建庫中使用的建庫試劑盒為Illumina 的NEBNext? UltraTM RNA Library Prep Kit，對mRNA 進行純化和片段化，制備cDNA 文庫。文庫庫檢合格后，將不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機數(shù)據(jù)量的需求集中后進行Illumina 測序。

1.10 RNA-Seq 數(shù)據(jù)分析

測序片段經(jīng)CASAVA 堿基識別轉(zhuǎn)化為序列數(shù)據(jù)(reads)，文件為fastq 格式。對原始數(shù)據(jù)進行過濾。主要包括去除帶接頭(adapter)的reads、去除含N(N表示無法確定堿基信息)的reads、去除低質(zhì)reads(Qphred ≤20 的堿基數(shù)占整個read 長度的50%以上的reads)。同時，對干凈數(shù)據(jù)(clean data)進行Q20、Q30 和GC 含量計算。后續(xù)所有分析均是基于clean data 進行的高質(zhì)量分析。

使用HISAT2 v2．0．5 構(gòu)建參考基因組的索引，并使用HISAT2 v2．0．5 將配對末端clean reads 與參照基因組比對。根據(jù)基因的長度計算每個基因的FPKM，并計算映射到該基因的讀數(shù)(FPKM 指每百萬堿基對測序的轉(zhuǎn)錄本序列片段的每千堿基片段的預(yù)期數(shù)量)。

1.11 差異表達基因及功能富集分析

使用DESeq2 R 軟件(1．16．1)進行兩個比較組合間的差異表達分析(每個組3 個生物學(xué)重復(fù))。使用Benjamini 和Hochberg 的方法來調(diào)整所得P值以控制錯誤發(fā)現(xiàn)率。通過DESeq2 發(fā)現(xiàn)調(diào)整的P值＜0．05 以及｜log2fold change ｜≥2 作為顯著差異表達的基因。通過ClusterProfiler R 軟件實現(xiàn)差異表達基因的GO 富集分析和KEGG 富集通路分析。

1.12 RT-qPCR 驗證分析

表1 Real-time PCR 引物序列Table 1 Primer sequences used for real-time PCR

1.13 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 19．0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時用ANOVA 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SFPS Ⅱ?qū)EL 和MRC-5 細胞增殖的影響

腫瘤細胞增殖是腫瘤發(fā)生和發(fā)展的最重要機制之一。由圖1 可知，與對照組相比，SFPS Ⅱ處理HEL 細胞24 h，SFPS Ⅱ濃度為10 μg.mL-1時，HEL 細胞增殖活性雖有降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0．05)；SFPS Ⅱ濃度為20 ～100 μg.mL-1時，可不同程度抑制HEL 細胞增殖活性，且隨著SFPS Ⅱ濃度的增加，其抑制細胞活性的作用逐漸增強，呈劑量依賴性。此外，SFPS Ⅱ處理HEL 細胞24 h 所對應(yīng)的半數(shù)最大抑制濃度(IC50)為72．78±2．01 μg.mL-1。MTT 法檢測發(fā)現(xiàn)，不同劑量的SFPS Ⅱ處理后，MRC-5 細胞活力不變(P＞0．05)，表明SFPS Ⅱ?qū)φ＜毎鸐RC-5 幾乎無細胞毒性。因此，取24 h 的IC50為最大用藥終濃度，即72 μg.mL-1SFPS Ⅱ作為后續(xù)機制研究最大用藥終濃度。

圖1 SFPS Ⅱ?qū)EL 和MRC-5 細胞存活率的影響(±s, n＝5)Fig. 1 Inhibitory effects of Sargassum fusiforme polysaccharide Ⅱ(SFPS Ⅱ) on the growth of human erythroleukemia (HEL) cells and human embryonic lung (MRC-5) cells(±s, n＝5)

2.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)評估及篩選差異表達基因

HEL 細胞經(jīng)SFPS Ⅱ處理后，經(jīng)Agilent 2100 精確檢測RNA 完整后進行文庫構(gòu)建。細胞對照組和SFPSⅡ處理組分別得到57 383 361．33 和55 107 124．67 個原始數(shù)據(jù)(raw data)，其中干凈序列(clean data)分別為56 065 294．67 和53 623 604．67 個，分別占原始數(shù)據(jù)的97．70%和97．31%(表2)。測序數(shù)據(jù)的質(zhì)量評估表明，每個樣品中去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)(phred)數(shù)值大于30 的堿基占總堿基的百分比(Q30)均高于92．80%，且每個測序周期中的GC 和AT 含量幾乎相等(表2)。HISAT2 比對軟件由約翰霍普金斯大學(xué)開發(fā)，該軟件采用全局和局部搜索的方法，利用大量FM 索引，覆蓋整個基因組，能夠?qū)NA-Seq 測得的reads 與基因組進行快速精確的比對，同時支持基因組特別大的物種。過濾后的數(shù)據(jù)使用HISAT2 軟件成功地將96．37%～96．73%平均長度為150 bp 的干凈序列與人類基因組成功匹配(Mapped reads)。SFPS Ⅱ處理組和對照組中有93．74%～93．92%的數(shù)據(jù)是比對到人類基因組唯一位置的(Unique mapped reads)。以上結(jié)果證明測序質(zhì)量相當(dāng)好，因此，隨后的轉(zhuǎn)錄組分析是可靠的。本試驗使用Cuffdiff 定量分析RPKM 的基因表達水平，每個基因的表達信號都被歸一化，符合標(biāo)準(zhǔn)的正態(tài)分布，并在圖2 中顯示SFPS Ⅱ處理組和對照組基因表達水平之間的差異，86．4%SFPS Ⅱ處理組和87．5%對照組的唯一表達基因在1 ～32 個拷貝數(shù)之間且沒有高于210個拷貝數(shù)的基因表達。經(jīng)過嚴格篩選(P＜0．05 且｜log2fold change ｜≥2)，共鑒定了1 248 個差異表達基因，紅色代表顯著上調(diào)基因，綠色代表顯著下調(diào)基因，藍色代表無顯著變化基因，其中17．55%(219)基因上調(diào)，82．45%(1 029)基因下調(diào)。這1 248 個表達差異基因由火山圖顯示(圖3)。

圖2 SFPS Ⅱ處理組和對照組中l(wèi)og2 基因表達分布圖Fig.2 Graph distribution of log 2-transformed gene expression in the SFPS Ⅱchallenge groups (SFPSⅡ)and the control (control)

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析Table 2 Statistical analysis of transcriptome sequencing data

圖3 SFPS Ⅱ處理后差異表達基因的火山圖Fig.3 DEGs identified after SFPS Ⅱexposure

2.3 GO 功能顯著性富集分析

對差異表達基因進行GO 功能分析，共得到464條GO 注釋，其中75%(348 條)GO 注釋為生物學(xué)過程，6．68%(31 條)GO 注釋為細胞組分，18．32%(85條)GO 注釋為分子功能(S2)(圖4)。差異表達基因的生物學(xué)功能變化最顯著的分子功能集中在DNA 構(gòu)象變化和對未折疊蛋白的反應(yīng)；細胞組分中，變化最顯著的集中在蛋白-DNA 復(fù)合物、核小體和DNA 包裝復(fù)合體；分子功能中，變化最顯著的集中在養(yǎng)載體活性和二羧酸跨膜轉(zhuǎn)運蛋白活性。生物學(xué)過程有個別顯著豐富的GO 注釋與凋亡和硫酸鹽轉(zhuǎn)運有關(guān)，如：膜電位調(diào)節(jié)(GO：0042391)、藥物運輸(GO：0015893)、黏膜固有免疫反應(yīng)(GO：0002227)、硫酸鹽跨膜轉(zhuǎn)運(GO：1902358)、 細胞對腫瘤壞死因子的反應(yīng)(GO：0071356)， 以及外在凋亡信號通路調(diào)控(GO：2001236)。這些結(jié)果表明SFPS Ⅱ可能通過改變核酸合成、轉(zhuǎn)錄及翻譯來調(diào)節(jié)HEL 細胞的生物學(xué)過程，激活細胞凋亡以及與細胞存活生長密切相關(guān)的免疫系統(tǒng)和代謝過程。

2.4 Pathway 顯著性富集通路分析

為了進一步研究差異表達基因的功能，進行了KEGG 富集分析。結(jié)果顯示(圖5)，人紅白血病HEL細胞響應(yīng)SFPS Ⅱ處理的1 248 個差異基因可以映射到256 條不同的生物途徑，顯著富集的途徑(P＜0．05)有16 條。差異表達基因的信號通路富集主要集中在系統(tǒng)性紅斑狼瘡、神經(jīng)活性配體-受體相互作用，病毒致癌、cAMP 信號通路以及Rap 1 信號通路。

2.5 RT-qPCR 驗證

為了證實RNA-Seq 數(shù)據(jù)的可靠性，隨機選擇了涉及不同功能的16 個差異基因進行RT-qPCR 分析。結(jié)果顯示，RNA-Seq 和RT-qPCR 的數(shù)據(jù)之間具有高度相關(guān)性(R2＝0．81)，并且通過RT-qPCR 確定的所選差異基因的表達與RNA-Seq 的表達基本相同(圖6～8)，說明通過RNA-Seq 確定的DEGs 的表達譜是可靠和準(zhǔn)確的。

3 討論

癌癥是一個重要的公共健康難題，腫瘤患者使用化療藥物后顯著的復(fù)發(fā)比例說明腫瘤有耐藥性，甚至患者在接觸具有不同結(jié)構(gòu)和作用機制的多種抗腫瘤藥物后導(dǎo)致腫瘤多藥耐藥性[34-35]，因此，化療出現(xiàn)的耐藥性是治療各種癌癥的主要障礙，治療癌癥亟需新一代藥物。

圖4 SFPS Ⅱ處理組和對照組差異表達基因的GO 功能顯著富集分析Fig.4 GO analysis of DEGs in the SFPS Ⅱversus the control

本研究從轉(zhuǎn)錄組概況分析SFPS Ⅱ抗腫瘤機制，研究了在紅白血病細胞株HEL 中加入SFPS Ⅱ后的細胞增殖能力。結(jié)果表明，SFPS Ⅱ能降低HEL 紅細胞對白血病細胞的細胞活力，說明SFPS Ⅱ可以抑制細胞增殖能力，降低細胞活力，且這些作用呈濃度依賴性，但對正常細胞株MRC-5 細胞無毒性作用。目前系統(tǒng)研究天然產(chǎn)物促進人紅細胞白血病細胞凋亡作用的報道較少。Cheng 等[36]利用流式細胞術(shù)檢測了黃芪提取物誘導(dǎo)的HEL 細胞凋亡，發(fā)現(xiàn)4．5 mg.mL-1黃芪提取物作用HEL 細胞3 ～5 d 后，能誘導(dǎo)HEL 細胞凋亡，且凋亡細胞的最大百分比(54．79%)出現(xiàn)在濃度為4．5 mg.mL-1，作用時間為5 d時，這表明黃芪提取物以濃度和暴露時間依賴性的方式誘導(dǎo)HEL 細胞凋亡，這與本研究結(jié)果一致。Fan 等[22]在不同的時間段(24、48 和72 h)研究不同濃度羊棲菜硫酸多糖(0、125、250、500、1 000 和2 000 μg.mL-1)對HepG2 細胞的細胞毒性作用，發(fā)現(xiàn)羊棲菜硫酸多糖對HepG2 細胞的生長有明顯的劑量和時間依賴性。羊棲菜硫酸多糖作用HepG2 細胞48 h的IC50為1 158．6 μg.mL-1，是本研究IC50的近15 倍，這意味著純化多糖SFPS Ⅱ具有更有效的抗腫瘤作用。上述研究只報道了天然產(chǎn)物對腫瘤細胞的抑制作用，對正常細胞是否有毒性尚未研究。本研究不僅設(shè)計了羊棲菜多糖對腫瘤細胞的試驗，而且分析了羊棲菜多糖對正常細胞的影響，結(jié)果表明羊棲菜多糖對腫瘤細胞具有選擇性，為了解SFPSⅡ誘導(dǎo)的抗腫瘤的分子機制，本研究首先分析了轉(zhuǎn)錄組差異表達基因，以鑒定表達受SFPS Ⅱ調(diào)控的基因。結(jié)果表明在SFPS Ⅱ作用下，存在大量差異表達基因。其中，219 個基因上調(diào)，1 029 個基因下調(diào)。此外，使用GO 和KEGG 數(shù)據(jù)庫對相關(guān)途徑的分析揭示了各種生物學(xué)過程和途徑。

眾所周知，細胞凋亡是細胞程序性死亡的過程，是引起癌細胞生長抑制的主要原因之一。Rap 1 是一種小GTP 酶，可以控制多種生物功能，如細胞粘附、細胞間連接形成和細胞急性。Rap 1 通過調(diào)節(jié)各種類型細胞中的整合素和其他粘附分子的功能，在細胞-細胞和細胞-基質(zhì)中起主要作用。Rap 1 還以高度依賴于細胞類型的方式調(diào)節(jié)MAP 激酶(mitogen-activated protein kinase， MAPK)的活性。劉云昊等[37]收集100例術(shù)前未進行放化療，且經(jīng)病理證實為癌組織的臨床標(biāo)本，通過免疫組化技術(shù)檢測RAP 1B 在胃癌組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胃癌組織中Rap 1B 表達率高達72%。鄒寒冰等[38]用白花蛇舌草處理人腎細胞腺癌ACHN 和人腎近曲小管HK-2 細胞24 h 后發(fā)現(xiàn)，ACHN 細胞增殖受到抑制，Rap 1GAP、Rap GEF3 和p-JNK 蛋白表達水平均顯著下調(diào)，表明白花蛇舌草可能通過抑制Rap 1-JNK 信號通路來選擇性抑制腎癌細胞ACHN 的增殖。SFPS Ⅱ作用HEL 細胞后信號通路顯著改變的包括Rap 1 信號通路，說明羊棲菜多糖可能也是通過Rap 1 信號通路來選擇性抑制HEL 細胞增殖，這需要通過特異性抑制劑阻斷Rap 1 信號通路來進一步驗證。本研究通過細胞抗腫瘤活性檢測和轉(zhuǎn)錄組差異基因表達分析，為SFPS Ⅱ?qū)EL 細胞發(fā)揮作用提供了新見解。高度受控的程序性細胞死亡已成為治療癌癥的關(guān)鍵點。盡管多糖是抗腫瘤的一個新研究領(lǐng)域，且其理論和臨床應(yīng)用尚待進一步深入研究，但毫無疑問，多糖是天然藥物研發(fā)的重要組成部分。因此，篩選可單獨使用或與其他化學(xué)治療藥物組合使用的海藻多糖以提高治療效果并減少癌癥治療中的副作用是一項重要的任務(wù)。

圖5 SFPS Ⅱ處理組和空白組差異表達基因的KEGG 信號通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis of DEGs in the SFPS Ⅱversus the control

圖7 RNA-Seq 和RT-qPCR 檢測的基因相關(guān)表達率Fig.7 Correlation of the expression ratio of selected genes measured by RNA-Seq and RT-qPCR

圖8 RT-qPCR 檢測SFPS Ⅱ處理組和對照組差異基因表達(±s, n＝9)Fig.8 The relative expression of the selected DEGs by RT-qPCR between SFPS Ⅱexposure group and control(±s, n＝9)

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)，羊棲菜硫酸多糖SFPS Ⅱ呈濃度依賴性地抑制HEL 細胞的體外增殖，表明SFPS Ⅱ具有抗腫瘤作用，可作為潛在的抗腫瘤藥物；轉(zhuǎn)錄組分析為SFPS Ⅱ?qū)EL 細胞的作用提供了數(shù)據(jù)資源，這為進一步研究SFPS Ⅱ抗HEL 腫瘤細胞活性機制提供了靶點及理論依據(jù)，可指導(dǎo)抗癌藥物的研發(fā)，從而更有效地預(yù)防和治療癌癥。