CO2和乙酸鈉對雨生紅球藻生長及其蝦青素積累的影響

葉 鑫 虞新磊 胡朝陽 徐年軍 孫 雪

(寧波大學海洋學院/浙江省海洋生物工程重點實驗室，浙江寧波 315211)

強抗氧化劑蝦青素(3， 3′-二羥基-4， 4′-二酮基-β， β′-胡蘿卜素)主要存在于甲殼動物、藻類和微生物中，具有抵御紫外線傷害、提高免疫力、抑制腫瘤生長等作用[1]。雨生紅球藻(Haematococcus pluvialis)是蝦青素的優質天然來源，其積累蝦青素量最高可達細胞干重的 4．6%[2]。雨生紅球藻是綠藻綱(Chlorophyceae)紅球藻科(Haematococcaceae)的一種單細胞微藻，在低光、營養充足的環境中藻細胞呈綠色游動狀態，生長分裂迅速；在高光、高鹽、低氮等不利環境下藻細胞鞭毛消失、細胞壁增厚并靜止不動開始積累蝦青素[3-4]。因此，目前利用雨生紅球藻生產蝦青素一般分兩個階段：首先在適宜的培養條件下促進綠色營養階段藻的生物量積累，然后利用高光強等因素誘導厚壁孢子階段藻細胞的蝦青素積累。在這兩個階段碳源對藻的生長和蝦青素積累都起著重要的作用。

CO2和碳酸氫鹽是雨生紅球藻培養中常用的無機碳源。與有機碳源相比，無機碳源可顯著降低培養基被微生物污染的風險。研究表明，適當提高CO2濃度不僅可以促進雨生紅球藻的生長[5]，還可刺激藻細胞脂質積累和蝦青素的合成[6-7]。與乙酸鹽相比較，碳酸氫鹽可誘導雨生紅球藻細胞產生更多的蝦青素，且持續補充5% CO2后雨生紅球藻蝦青素合成速率與含量更高，最大分別可達6．25 mg.L-1.d-1和175．7 mg.L-1[8]。除無機碳源外，雨生紅球藻也可以利用乙醇、乙酸鹽、甘油、葡萄糖等常見有機碳源進行兼養生長[9-12]。其中，乙酸鹽是雨生紅球藻培養中常用的廉價有機碳源。乙酸鹽可增強雨生紅球藻的呼吸作用，減少蝦青素積累時期高光脅迫對藻細胞的損傷，促進藻的生長和蝦青素的積累[13]，但乙酸鹽培養雨生紅球藻存在容易污染微生物、藻細胞活力低等問題[14]。研究表明，在雨生紅球藻培養過程中補充C5 有機碳可以極大地提高藻的生物量，改善藻細胞活力，且能減少污染[15]。

綜上，無機碳源和有機碳源在促進雨生紅球藻生長和蝦青素積累方面發揮了重要的作用。本研究選用4 倍空氣CO2濃度(0．16% CO2)和響應面法優化所得的乙酸鈉濃度(0．023 mol.L-1)，比較了這2 種碳源對雨生紅球藻生長、蝦青素含量、酶活性和基因表達等參數的影響，以期為高效培養雨生紅球藻、提高蝦青素產量提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與分組試驗

雨生紅球藻藻株489，由寧波大學海洋生物工程重點實驗室藻種庫提供，基礎培養基為NBM3#培養基[16]。綠色營養階段培養條件：溫度為25±0．5℃，光通量為40 μmol.m-2.s-1，光暗周期比為12 h ∶12 h，初始接種密度約為4×104個.mL-1。厚壁孢子培養：將生長到平臺期的綠色營養階段藻4 000 r.min-1離心5 min，收集藻細胞接入到等體積新鮮培養基中進行高光脅迫(光通量150 μmol.m-2.s-1)以誘導蝦青素合成，培養溫度和光周期與綠色營養階段相同。

試驗共設置3 組處理：對照組(正常空氣，0．04%CO2)、高CO2組(0．16% CO2)、乙酸鈉組(正常空氣+0．023 mol.L-1乙酸鈉)。除碳源不同外，其他培養條件均相同。以上及后續試驗每組均設置3 個生物學重復。

1.2 試驗方法

1．2．1 細胞形態觀察 分別在綠色營養階段培養1、5、8 d 時和厚壁孢子階段培養1、3、5、8 d 時取3 mL 藻液4 000 r.min-1離心5 min，將藻體沉淀重懸于300 μL新鮮培養基中(后期藻液密度高時進行稀釋)，制片后在CX21FS1 顯微鏡(OLYMPUS，日本)下放大400 倍觀察藻細胞形態和游動性并拍照記錄。

1．2．2 細胞生長曲線測定 在綠色營養階段培養過程中，每天定時取樣，使用UV-5200 紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)測定680 nm 波長處的吸光度值(OD680)，根據OD680(x)與細胞密度(y)關系曲線y＝8．326 2x+0．072 7(R2＝0．993 4)計算藻細胞密度。

1．2．3 干重測定 在兩個階段雨生紅球藻培養的第8 天，分別于6 500 r.min-1離心(4℃)10 min 收集藻體，將藻體沉淀冷凍干燥48 h 后準確稱重，然后將干藻粉保存在-80℃并用于后續試驗。

1．2．4 可溶性蛋白、總脂、總糖含量測定 分別稱取培養第8 天兩個階段的干藻粉各0．1 g(干重，DW)，在液氮中充分研磨后，加入4 mL pH 值7．4 的磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，渦旋混合均勻后于6 500 r.min-1(4℃) 離心10 min，保留上清液。利用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量法測定可溶性蛋白含量[17]；利用香草醛法測定總脂含量[18]；使用總糖含量測試盒(蘇州科銘生物技術有限公司)測定總糖含量。

1．2．5 蝦青素含量測定 參考崔丹丹等[19]的方法。準確稱取0．01 g 厚壁孢子階段(第8 天)的干藻粉，加入10 mL 5% KOH+30%甲醇，室溫靜置5 min；6 000 r.min-1離心(4℃)3 min 后取藻體沉淀研磨5 min，然后加入10 mL 二甲基亞砜在30℃水浴中抽提蝦青素。反復抽提至藻體變白后，用UV-5200 紫外可見分光光度計測定OD490。蝦青素含量計算公式為：

式中，C 為蝦青素含量，mg.g-1DW；OD490為樣品在490 nm 處的吸光度值；m 為樣品干重。

1．2．6 基因轉錄表達分析 在雨生紅球藻綠色營養階段的第4 ～第6 天和厚壁孢子階段的第1 ～第3 天，每天分別離心收集藻體，使用Trizol 試劑(Invitrogen，美國) 提取藻的總RNA。分別使用iScript cDNA Synthesis kit 和iTaq Universal SYBR Green Supermix 試劑盒(Bio-Rad，美國)進行RNA 反轉錄和熒光定量PCR。采用2-ΔΔCT法[20]計算基因的相對表達量。熒光定量PCR 引物采用Primer Premier 5．0 軟件設計，所用基因序列來自寧波大學藻類生物資源利用團隊的雨生紅球藻轉錄組測序結果(表1)。

1．2．7 酶活力測定 取綠色營養階段培養4、5、6 d和厚壁孢子階段培養1、2、3 d 時的藻液，6 500 r.min-1(4℃)離心10 min，每組取0．5 g 藻體(濕重，FW)，經液氮研磨后，2 000 r.min-1(4℃)離心10 min，上清液即為粗酶液。核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)活力測定方法參考李合生[21]的分光光度法，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase， PEPC) 和蘋果酸脫氫酶( malate dehydrogenase，MDH)活力測定均使用蘇州科銘生物有限公司的試劑盒。

表1 熒光定量PCR 的引物信息Table 1 Primer information for real-time quantitative PCR

1.3 數據統計與分析

所有數據均用平均值±標準差(mean±SD，n＝3)表示。數據分析和作圖使用Microsoft Office Excel 2017，并采用軟件SPSS 22．0 的單因素方差(one-way ANOVA)分析數據之間差異顯著性，P＜0．05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 碳源對綠色營養階段雨生紅球藻細胞狀態和生長的影響

在綠色營養階段，不同碳源對雨生紅球藻細胞狀態的影響較明顯(圖1)。培養前4 天時，3 組藻細胞都呈游動狀態，細胞活力較好。對照組雨生紅球藻從培養第7 天開始細胞活力減弱，少數藻的細胞壁開始變厚；高CO2組在培養第8 天時雨生紅球藻細胞活力仍然較好，呈游動細胞狀態；乙酸鈉組在培養第5 天時大約有10%～20%的藻細胞壁增厚變成厚壁孢子，培養第8 天時約有70%～80%的細胞靜止不動，約30%～40%藻細胞開始積累蝦青素。

由圖2 可知，補充CO2和乙酸鈉對雨生紅球藻生長的促進作用明顯。培養1 d 時，藻細胞處于延滯期，細胞分裂緩慢；培養2 ～6 d 時，高CO2和乙酸鈉組藻細胞生長速度超過了對照組，但兩組之間無顯著差異；培養7～8 d 時，高CO2組藻細胞密度顯著高于乙酸鈉組。培養第8 天時，高CO2、乙酸鈉組藻細胞密度分別為對照組的2．55、2．23 倍(圖2)，干重分別為對照組的1．81、1．56 倍(表2)。綜上，提高CO2濃度或補充乙酸鈉都可顯著促進雨生紅球藻的快速生長，且在培養后期CO2的促進作用大于乙酸鈉。

2.2 碳源對綠色營養階段雨生紅球藻生理生化參數的影響

雨生紅球藻的生理生化參數受CO2濃度和乙酸鈉的影響(表2)。高CO2組和乙酸鈉組藻的可溶性蛋白含量顯著高于對照組，分別為對照組的1．89 和1．23 倍(P＜0．05)；高CO2組和乙酸鈉組藻的總糖含量分別是對 照 組的0．77(P＜0．05)、1．09 倍(P＞0．05)；高CO2組和乙酸鈉組藻的總脂含量分別為對照組的0．65 和1．26 倍(P＜0．05)。以上結果表明，CO2促進了綠色營養階段雨生紅球藻蛋白質的合成，抑制了其碳水化合物和脂類合成，而乙酸鈉則促進了藻細胞蛋白質和脂類的積累。

2.3 碳源對綠色營養階段雨生紅球藻生長相關基因表達及酶活力的影響

雨生紅球藻中Rubisco 大亞基、PEPC 和MDH 的編碼基因——rbcL、pepc2、mdh的轉錄表達對外源添加碳源的響應不同(圖3)。培養4 ～6 d，高CO2組中rbcL轉錄表達較穩定且與對照組無顯著差異，而乙酸鈉組藻rbcL 表達量在培養第5 和第6 d 時分別下降至對照組的57%和39%。在培養4～6 d 時，pepc2 和mdh表達量在2 種碳源添加組中均較對照組升高，但兩組間基本無顯著差異(pepc2 在培養第6 天時除外)。

CO2或乙酸鈉均顯著影響雨生紅球藻中Rubisco、PEPC 和MDH 活力(圖4)。培養過程中高CO2組藻細胞Rubisco 活力較為穩定，且在培養第5 和第6 天時顯著高于其他兩組，表明適當提高CO2濃度可以增強Rubisco 活力；乙酸鈉組中Rubisco 活力在培養前期與對照組無顯著差異，在培養第6 天時較對照組顯著下降。PEPC 和MDH 對高CO2和乙酸鈉的響應相似，培養4～6 d 時較對照組均升高，在第6 天時，高CO2和乙酸鈉組藻的PEPC 活力分別升高至對照組的1．98和1．45 倍，MDH 活力則分別升高至對照組的2．38 和2．01 倍。培養第6 天時，乙酸鈉組的2 種酶活力均低于高CO2組。以上結果表明，2 種碳源都可通過顯著提高PEPC、MDH 的活力來加速檸檬酸循環，為藻細胞生長提供充足能量。

2.4 碳源對厚壁孢子階段雨生紅球藻細胞形態的影響

由圖5 可知，2 種碳源對厚壁孢子階段藻細胞的影響不同。對照組在高光脅迫第1 天，細胞活力降低并少量積累蝦青素，但大部分細胞仍呈游動狀態；從脅迫第3 天開始部分細胞轉為厚壁孢子，并有少量細胞溶解；脅迫第8 天時，大部分藻細胞積累蝦青素變紅，但仍有部分藻細胞為綠色。高CO2組中，高光脅迫第1 天，藻細胞活力好，游動速度快；脅迫第3 天時，少量藻細胞開始積累蝦青素；脅迫第5 天時大量細胞轉化為厚壁孢子同時細胞顏色變紅；脅迫第8 天時，藻細胞中已積累較多蝦青素，但藻細胞狀態較好，基本無細胞溶解。乙酸鈉組中，高光脅迫后蝦青素快速積累，在脅迫第1 天時90%以上的藻細胞已變成厚壁孢子；脅迫3～8 d 時，細胞內紅色區域不斷擴大，表明蝦青素持續積累，但從脅迫第5 天開始有少數藻細胞開始溶解，且溶解細胞數隨著脅迫時間延長而增多。

圖2 綠色營養階段雨生紅球藻的生長曲線Fig.2 The growth curve of H. pluvialis at green vegetative stage

表2 綠色營養階段雨生紅球藻生理生化參數Table 2 Physiological and biochemical parameter of H. pluvialis at green vegetative stage

圖3 綠色營養階段雨生紅球藻生長相關酶的轉錄水平變化Fig.3 Expression levels of the growth-related enzymes of H. pluvialis at green vegetative stage

2.5 碳源對厚壁孢子階段雨生紅球藻生理生化參數的影響

在厚壁孢子階段，高CO2組和乙酸鈉組雨生紅球藻的生理生化參數與對照組差異顯著(除總脂含量外)(表3)。在脅迫第8 天時，3 個試驗組藻細胞干重分別為0．24、0．47、0．37 g.L-1。以單位體積藻液來計算，高CO2組和乙酸鈉組中蝦青素含量分別為2．76和2．13 mg.L-1，分別是對照組的2．40 和1．85 倍。可見補充CO2或乙酸鈉后藻細胞中蝦青素濃度顯著提高，且高CO2組大于乙酸鈉組。

厚壁孢子階段雨生紅球藻的可溶性蛋白含量由高到低表現為高CO2組＞乙酸鈉組＞對照組。兩個處理組中藻的總糖含量均顯著低于對照組，但兩組間無顯著差異；碳源種類對厚壁孢子階段藻總脂含量無顯著影響。

2.6 碳源對厚壁孢子階段雨生紅球藻基因表達和酶活力的影響

在厚壁孢子階段雨生紅球藻中，蝦青素代謝相關酶八氫番茄紅素脫氫酶(phytoene desaturase，PDS)、β-胡蘿卜素羥化酶(β-carotene hydroxylase，CHY)和β-胡蘿卜素酮化酶(β-carotene ketolase，BKT)的編碼基因——pds、chy和bkt2 的轉錄表達對2 種碳源的響應類似(圖6)。在脅迫1 ～2 d 時，高濃度CO2總體抑制3 個蝦青素合成相關基因的轉錄表達，而在脅迫第3天時，高CO2組中3 個蝦青素合成相關基因表達量上調，與乙酸鈉組無顯著差異。與高CO2組不同，乙酸鈉組顯著促進了3 個蝦青素合成相關基因的表達。脅迫第1 天時，高CO2組pds、chy、bkt2 基因表達水平約為對照組的31%、41%和42%，而乙酸鈉組3 個基因表達量分別為對照組的3．11、2．94 和4．18 倍。

圖5 厚壁孢子階段雨生紅球藻細胞形態Fig.5 Cell morphology of H. pluvialis at red cyst stage

在厚壁孢子階段，雨生紅球藻Rubisco 活力對CO2或乙酸鈉的響應不同(圖7)。在對照組與高CO2組中，Rubisco 活力隨著高光脅迫時間延長逐漸上升，而乙酸鈉組Rubisco 活力在脅迫1 ～3 d 內無明顯變化。脅迫1～3 d 時，與對照組相比，高CO2組促進了雨生紅球藻Rubisco 活力的升高，而乙酸鈉則主要抑制了Rubisco 活力。在高光脅迫第3 天時，高CO2組和乙酸鈉組Rubisco 活力分別為對照組的1．41 和0．50 倍(P＜0．05)。雨生紅球藻中PEPC、MDH 活力在兩個處理組中的變化類似，活力均較對照組提高。

表3 厚壁孢子階段雨生紅球藻生理生化參數和蝦青素含量Table 3 Physiological and biochemical parameter and astaxanthin content of H. pluvialis at red cyst stage

3 討論

3.1 CO2 和乙酸鈉對雨生紅球藻生長的影響

CO2是藻類生長的重要碳源，因此在微藻培養過程中適當提高環境CO2濃度，可以促進藻細胞的光合作用，加速藻類生長。轉錄組測序結果表明，用15%CO2培養雨生紅球藻后，其光合作用、糖酵解、碳固定途徑等相關基因的表達均上調[22]。本研究結果顯示，CO2濃度從0．04%提高至0．16%后，藻生長加快，其細胞密度和干重都增加，這可能與藻的光合作用、能量代謝增強有關。同時，較高的CO2濃度可以延緩藻細胞衰老，提高細胞的活力，因此在培養第8 天時藻細胞活力仍較好，細胞壁也未變厚。

乙酸鹽是微藻培養中常用的有機碳源，可以使藻進行異養生長。乙酸鹽進入藻細胞后在乙酰CoA 合成酶(acetyl-CoA synthetase，ACS)的催化作用下直接生成乙酰CoA，后者又可以參與到檸檬酸循環和脂質合成等代謝過程中。乙酸鈉可以促進聚球藻(Synechococcus leopoliensis)生長，其主要原因是由于乙酸鈉增加了檸檬酸循環中的碳代謝流量[23]。本研究添加乙酸鈉后雨生紅球藻生長加快，但在培養后期，藻的生長速度和生物量均低于高CO2組，這可能與后期乙酸鈉組游動藻細胞數量減少，部分藻細胞壁逐漸變厚并開始積累蝦青素有關。Pang 等[15]發現添加乙酸鈉會導致雨生紅球藻游動性變差，培養至第7 天時游動細胞數量只占總細胞數的7%，本研究結果與之相似。

圖7 厚壁孢子階段雨生紅球藻生長相關酶活力Fig.7 Activities of growth-related enzymes of H. pluvialis at red cyst stage

Rubisco 作為光合作用的關鍵酶之一，在植物細胞中主要起固定CO2的作用。加富1 000 ～1 500 μmol.L-1CO2可提高Rubisco 和Rubisco 活化酶的活力，從而提高黃瓜葉片凈光合速率[24]。CO2濃度升高可促進擬柱胞藻(Cylindrospermopsis raciborskii)光捕獲效率和光合作用能量轉換效率，使Rubisco 活力增強[25]。本研究中高濃度CO2促進了雨生紅球藻Rubisco 活力升高，提高了細胞固碳和光合效率，從而加速了藻的生長。乙酸鈉會抑制雨生紅球藻Rubisco活力和Rubisco 編碼基因的表達[26]，本研究中乙酸鈉組藻細胞Rubisco 活力及rbcL表達水平在培養后期均下降，該結果與以上報道一致。PEPC、MDH 在植物細胞內均可以催化草酰乙酸的生成，而草酰乙酸是檸檬酸循環中的一個重要中間產物。本研究中，CO2或乙酸鈉均提高了雨生紅球藻中PEPC、MDH 活力及其相關編碼基因的轉錄表達，CO2比乙酸鈉提高效果更明顯。可見， CO2濃度升高可以促進雨生紅球藻Rubisco、PEPC 和MDH 活力增強，加快光合作用和檸檬酸循環，從而促進藻生物量的積累；而乙酸鈉則主要通過加速檸檬酸循環為細胞代謝提供更多能量，從而促進藻的生長。

無論在高光還是低光培養條件下，2 種碳源處理組雨生紅球藻Rubisco 活力變化趨勢基本一致，即高CO2濃度增強Rubisco 活力，乙酸鈉則抑制其活力。曾曉鵬等[27]發現160 μmol.m-2.s-1光強培養下，高CO2濃度可顯著增強三角褐指藻Rubisco 活力，使得藻細胞的凈光合效率得到提高。Zhang 等[13]發現添加乙酸鈉后，雨生紅球藻葉綠素熒光參數和光合速率下降，光合作用減弱，該結果與本研究中乙酸鈉對Rubisco 活力的影響類似。在綠色營養和厚壁孢子階段，雨生紅球藻中PEPC 和MDH 活力均受高濃度CO2或乙酸鈉的誘導，但誘導程度不同。

3.2 CO2 和乙酸鈉對雨生紅球藻蝦青素積累的影響

本研究中，乙酸鈉的添加對雨生紅球藻蝦青素合成有較大的影響。在綠色營養階段后期，乙酸鈉組中約30%～40%的雨生紅球藻細胞開始合成蝦青素；高光脅迫開始后藻細胞中蝦青素合成更加快速，在脅迫第1 天藻細胞即快速變紅。在高光脅迫條件下，乙酸鈉促進雨生紅球藻合成蝦青素可能與乙酸鈉可增強細胞呼吸速率，為蝦青素合成提供充足碳骨架、提高藻細胞自身光保護作用有關[13]。

PDS、CHY、BKT 是參與蝦青素合成的關鍵酶。本研究高CO2組中，這3 種酶的編碼基因表達量在脅迫1～2 d 時降低或無明顯差異，在脅迫第3 天時上升；而乙酸鈉組中，3 個相關基因在脅迫第1 天就開始快速大量表達，說明乙酸鈉促進蝦青素積累的速度比高CO2要快，而且這3 個蝦青素代謝相關酶的轉錄水平變化與高CO2組藻細胞變紅速度慢于乙酸鈉組的現象一致。Cheng 等[9]利用2%～10%CO2誘導雨生紅球藻積累蝦青素，0 ～5 d 時所有試驗組蝦青素積累量均較低，而從第5 天開始蝦青素快速合成，這一現象與本研究類似。另外，Gao 等[28]研究表明，乙酸鈉在第0．5或第2 天能快速促進雨生紅球藻蝦青素合成相關酶編碼基因的表達，如八氫番茄紅素合酶基因(phytoene synthase，psy)、番茄紅素β-環化酶基因(lycopene beta cyclase，lyc)以及bkt基因。

4 結論

在綠色營養階段，2 種碳源均可以加快藻的生長、可溶性蛋白的合成，增強PEPC、MDH 活力及其基因轉錄表達。在厚壁孢子階段，2 種碳源均可以提高藻的生物量、蝦青素產量、3 個蝦青素合成相關酶的轉錄水平以及PEPC 和MDH 活力。綜上，適當補充CO2或乙酸鈉均可促進雨生紅球藻生物量和蝦青素的積累，但高CO2濃度培養的藻細胞狀態好，乙酸鈉則在促進蝦青素的快速積累方面表現出一定優勢。本研究在一定程度上闡明了這2 種碳源促進雨生紅球藻生長和蝦青素積累的機理，為開展雨生紅球藻蝦青素的高效生產提供了參考。