青海高原油菜蜜穩(wěn)定同位素產(chǎn)地特征與環(huán)境響應(yīng)機(jī)制研究

譚 陽(yáng) 劉 志 韓 燕 崔明明 肖 明 耿貴工 孫小鳳 袁玉偉

(1青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；2 浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品信息溯源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021)

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜或蜜露，與其自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)充分釀造而成的天然甜味物質(zhì)。蜂蜜被列入我國(guó)《藥食同源食品目錄及新資源食品名單》87 種藥食同源目錄中，常作為藥品生產(chǎn)中較好的甜味劑、粘合劑、抗氧劑[1]，被稱為“天然抗生素”。我國(guó)是世界上蜂蜜出口量最大的國(guó)家之一，主要出口日本、美國(guó)和歐盟等國(guó)[2]，這些國(guó)家對(duì)蜂蜜的進(jìn)口檢測(cè)指標(biāo)多，且嚴(yán)格[3]，導(dǎo)致一些名優(yōu)產(chǎn)地標(biāo)識(shí)蜂蜜更是供不應(yīng)求，其中高原蜂蜜蜜質(zhì)濃稠，活性高，營(yíng)養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。研究發(fā)現(xiàn)，青海油菜蜜中葡萄糖和果糖等還原糖含量遠(yuǎn)高于國(guó)家要求的60%，而蔗糖含量?jī)H為0．42%～1．96%，且淀粉酶值高，富含氨基酸、維生素和微量元素[4-5]，受到了消費(fèi)者的普遍青睞，具有較高的市場(chǎng)價(jià)格和競(jìng)爭(zhēng)力。但近年來(lái)蜂蜜市場(chǎng)人為摻假及產(chǎn)地誤標(biāo)現(xiàn)象頻發(fā)，對(duì)蜂蜜進(jìn)行真實(shí)性及產(chǎn)地溯源技術(shù)研究變得更為迫切[6]。

蜂蜜的產(chǎn)地溯源與摻雜鑒別技術(shù)主要包括液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)(liquid chromatography-electrochemical detection，LC-ECD)[7]、穩(wěn)定同位素分析(stable isotope analysis， SIR)[8]、近紅外光譜分析(near-infrared spectral analysis， NIR)[9]、礦物元素分析(elemental analysis， EA)[10]等。其中，穩(wěn)定同位素分析技術(shù)是當(dāng)前國(guó)際上廣泛認(rèn)可的、較可靠的農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地溯源技術(shù)之一，已在葡萄酒[11-12]、橄欖油[13-14]、茶葉[15-16]、大米[17-18]、肉類[19-20]、奶粉[21-22]等中廣泛應(yīng)用。近年來(lái)，蜂蜜假冒技術(shù)不斷變換，如不同植物糖漿摻雜[23]、花粉過(guò)濾和替換等，傳統(tǒng)的依靠總體糖類或花粉穩(wěn)定同位素分析的鑒別手段面臨巨大挑戰(zhàn)[24]，亟需開(kāi)發(fā)更為可靠、精準(zhǔn)的蜂蜜產(chǎn)地溯源與鑒別策略。已有研究表明，蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定同位素特征值較蜂蜜總體值更穩(wěn)定，且不易受人為干擾[25]，如蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的同位素組成不受摻雜植物糖的影響，能夠較準(zhǔn)確地反映蜂蜜的真實(shí)來(lái)源。蜂蜜中蛋白質(zhì)由蜜源植物花粉顆粒和蜜蜂提供[26]，是蜂蜜特有的內(nèi)標(biāo)物，其組成和含量與蜜源植物、季節(jié)、放蜂環(huán)境、地域等諸多因素有關(guān)[27]。Schellenberg 等[28]利用蜂蜜蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素分析技術(shù)，對(duì)歐洲20 個(gè)地區(qū)的正宗蜂蜜進(jìn)行了產(chǎn)地溯源，對(duì)選定區(qū)域樣品的分類正確率超過(guò)70%。Kropf等[29-30]利用蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素分析技術(shù)結(jié)合全反射X 熒光分析儀( total-reflection X-ray fluorescence spectroscopy，TXRF)實(shí)現(xiàn)了斯洛文尼亞不同自然區(qū)域(高山、地中海、迪納拉山脈、潘諾尼亞)3 種蜂蜜的地理來(lái)源區(qū)分，其中椴樹(shù)蜜的產(chǎn)地識(shí)別正確率達(dá)到100%，刺槐和栗樹(shù)蜜識(shí)別正確率分別為98．2%和94．6%。

本研究擬采用元素分析-穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜(elementary analyzer-stable isotope ratio mass spectrometers，EA-IRMS)技術(shù)測(cè)定青海5 個(gè)不同產(chǎn)地(西寧市、海東市、海北州、海南州、海西州)油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素比率(δ13C、δ15N、δ2H、δ18O)，對(duì)比不同產(chǎn)地間油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素特征的差異及其隨年際間氣候因素(降雨)的變化規(guī)律，闡明蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素隨產(chǎn)地環(huán)境因子變化的分餾機(jī)制及產(chǎn)地溯源的內(nèi)在機(jī)理，以期為青海特色高原油菜蜜真實(shí)性鑒別研究提供理論依據(jù)與技術(shù)支撐，促進(jìn)青海蜂蜜產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

于2016—2018年每年的7—8月，分別從青海省西寧市、海東市、海北州、海南州、海西州5 個(gè)行政區(qū)域?qū)嵉夭杉冋筒嗣蹣悠饭灿?jì)71 份，每份樣本至少采集500 g， 4℃冷藏密封保存。具體采樣信息見(jiàn)表1。

表1 油菜蜜采樣區(qū)域及數(shù)量Table 1 Sampling area and quantity statistics of rapeseed honey

鎢酸鈉、硫酸，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。國(guó)際原子能機(jī)構(gòu)穩(wěn)定同位素標(biāo)準(zhǔn)品：IAEACH-6(δ13C ＝-10．4‰)；IAEA-CH-7(δ13C ＝-32．2‰，δ2H ＝-100．3‰)；IAEA-600(δ13C ＝-27．8‰，δ15N ＝1．0‰)；B2174(δ13C ＝-37．3‰，δ15N ＝-0．5‰)；B2203(δ13C＝-27．9‰，δ2H＝-25．3‰，δ18O＝21．0‰)。

1.2 儀器與設(shè)備

Elementarvario PYRO cube元素分析儀，德國(guó)Elementar 公司；Isoprime 100 穩(wěn)定同位素比率質(zhì)譜儀，英國(guó)Isoprime 公司；XP6 電子天平(精確度1 μg ～6．1 g)，美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；FZG-20 冷凍干燥機(jī)，美國(guó)Labconco 公司；FW-100 萬(wàn)能粉碎機(jī)，天津市泰斯特儀器有限公司；FDY1001-UV-P 超純水儀，青島富勒姆科技有限公司；HH-M4 恒溫水浴鍋，上海錦屏儀器儀表有限公司；TDL-5-A 離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品處理 蜂蜜樣品前處理：對(duì)于有結(jié)晶的樣品，于40℃水浴中使其全部融化，攪拌均勻后冷卻至室溫；對(duì)于無(wú)結(jié)晶樣品，直接攪拌均勻。然后準(zhǔn)確稱量1．5 mg 用于測(cè)定δ13C 值。

蜂蜜蛋白質(zhì)提取：稱取10 ～12 g 蜂蜜樣品于50 mL離心管中，加入4 mL 純水、2 mL 沉淀劑(10%鎢酸鈉溶液)和2 mL 0．335 mol.L-1硫酸溶液，混勻置于80℃水浴中加熱不少于30 min，振蕩觀察是否有絮狀物析出，含有絮狀物樣品以水注滿離心管(若無(wú)絮狀物析出則重新提取)，混合后4 800 r.min-1離心5 min，棄上清液，用冷水反復(fù)洗滌沉淀物5 次，得到蜂蜜蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)沉淀物在75℃烘箱中干燥3 h 以上，5 ～10℃密封冷藏，用于碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素測(cè)定。

1．3．2 碳、氮穩(wěn)定同位素測(cè)定 為保證樣品的IRMS檢測(cè)信號(hào)響應(yīng)值在2～10 nA 之內(nèi)，初探試驗(yàn)確定了蜂蜜蛋白質(zhì)粉末稱樣量為1．0 mg，蜂蜜稱樣量為1．5 mg，用錫箔杯包成方塊狀，一式3 份，壓擠排出空氣，通過(guò)120 位自動(dòng)進(jìn)樣器進(jìn)入元素分析儀中，經(jīng)高溫充分燃燒并充分氧化還原后，樣品中碳、氮元素分別轉(zhuǎn)化為純凈的CO2和N2，經(jīng)稀釋后進(jìn)入同位素質(zhì)譜儀檢測(cè)。具體參數(shù)如下：元素分析儀的氧化爐和還原爐溫度分別為 920 和 600℃，氦氣吹掃流量為230 mL.min-1；同位素質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)間設(shè)置為550 s，N2和CO2作為參考?xì)狻?/p>

1．3．3 氫、氧穩(wěn)定同位素測(cè)定 稱取1．0 mg 蜂蜜蛋白質(zhì)粉末，用銀杯包成方塊，一式2 份，壓擠排出空氣，由自動(dòng)進(jìn)樣器送入元素分析儀，經(jīng)高溫裂解，產(chǎn)生純凈的CO 和H2，稀釋后進(jìn)入同位素質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測(cè)。具體參數(shù)如下：氦氣流量為125 mL.min-1，燃燒爐溫度為1 450℃；同位素質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)間設(shè)置為950 s，O2和H2作為參考?xì)狻?/p>

1．3．4 穩(wěn)定同位素比率計(jì)算 由于元素重同位素自然豐度相對(duì)較低，儀器獲取的重、輕同位素的比率值(R)極小。國(guó)際上通常采用將己知同位素比率的標(biāo)準(zhǔn)品作為參照，計(jì)算未知樣本中穩(wěn)定同位素比率的相對(duì)值。

穩(wěn)定性同位素比率計(jì)算公式如下[31]：

式中，R樣品為所測(cè)樣品中重同位素與輕同位素豐度比，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R標(biāo)準(zhǔn)為相應(yīng)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)樣品中重同位素與輕同位素豐度比，δ13C 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為V-PDB(維也納-PeeDee 箭石標(biāo)準(zhǔn))，δ15N的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為AIR(大氣氮)，δ18O 和δ2H 的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)為VSMOW(標(biāo)準(zhǔn)平均海洋水)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel 2010 進(jìn)行初步的數(shù)據(jù)整理及線性回歸分析，利用SPSS 19．0 軟件(IBM，USA)對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA、LSD多重比較，顯著水平設(shè)定為P＜0．05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)中穩(wěn)定同位素比率特征

71 份青海省油菜蜜樣品δ13C 值范圍為-27．7‰～-23．7‰，主要分布在-26．0‰～-24．0‰之間，而蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的δ13C 值范圍為-26．9‰～-23．2‰，主要分布在-25．0‰～-24．0‰之間(表2)；這與李沈軼等[25]的研究結(jié)果一致。蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的δ13C 值代表蜂蜜產(chǎn)地更為真實(shí)的碳循環(huán)環(huán)境，不易受蜂蜜中C4植物糖摻雜的影響，其特征值較蜂蜜中總δ13C 更穩(wěn)定，更能作為產(chǎn)地的特征指標(biāo)。此外，蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ15N 值范圍為0‰～6．1‰，主要分布在0‰～2．0‰之間，δ2H 值范圍為-136．8‰～-78．9‰，主要分布在-125．0‰～-95．0‰之間，δ18O值范圍為9．2‰ ～17．1‰，主要分布在13．0‰～15．0‰之間。

表2 青海省油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)中穩(wěn)定同位素比值(n＝71)Table 2 Stable isotope ratios of endogenous proteins in rapeseed in Qinghai province(n＝71)

2.2 油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素特征年際變化

利用單因素方差分析(One-way ANOVA)方法對(duì)青海省2016—2018年油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的穩(wěn)定碳、氮、氫、氧同位素比率值進(jìn)行年際間比較，結(jié)果如圖1所示。年際間δ13C、δ15N、δ2H 值無(wú)顯著差異(P＞0．05)，3年油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的δ13C 平均值分別為-25．2‰、- 24．6‰、 - 25．1‰； δ15N平均值分別為0．9‰、1．7‰、1．2‰；δ2H 平均值分別為-107．6‰、-102．5‰、-108．6‰，且均無(wú)顯著差異(P＞0．05)。但其3年的δ18O 值之間存在極顯著差異(P＜0．01)，平均值分別為14．8‰、13．8‰、12．4‰，不同年份間表現(xiàn)為2016年＞2017年＞2018年。蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的δ18O值主要與蜜源植物產(chǎn)地環(huán)境的降水、灌溉水和地下水有關(guān)。Tomiyama 等[32]對(duì)來(lái)自不同區(qū)域的大米樣品和其相應(yīng)種植地塊周圍環(huán)境水的δ18O 進(jìn)行了測(cè)定，發(fā)現(xiàn)二者之間存在顯著相關(guān)性，證明氧同位素為產(chǎn)品的溯源提供了較好的地理信息。而由于不同區(qū)域的海拔、溫度具有一定差異，導(dǎo)致環(huán)境水中氧同位素在蒸騰、冷凝及在蜜源植物利用過(guò)程中自然分餾，同位素比率發(fā)生相應(yīng)變化。蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)中氧同位素相比于碳、氮同位素具有更大的地域差異，能夠提供更為明確的地理差異特征。

2.3 油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)氫、氧穩(wěn)定同位素特征與降雨的相關(guān)性

圖1 青海省不同年份(2016—2018)油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的碳、氮、氫、氧穩(wěn)定同位素比值變化Fig.1 Variations of C、N、H、O stable isotope ratios in endogenous proteins of honey samples in Qinghai province from 2016 to 2018

蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ2H、δ18O 值和植物蜜腺中氫、氧穩(wěn)定同位素密切相關(guān)，而后者往往受當(dāng)?shù)亟涤昵闆r的影響。2017年春季，受水汽環(huán)流影響，青海省出現(xiàn)氣候異常，降雨量較往年偏多。全省主要降水過(guò)程達(dá)11次，降水量平均112．9 mm，較往年多30%[33]。2018年春季，受新疆冷空氣影響，青海省降雨次數(shù)及數(shù)量大幅增加[34]，大部分區(qū)域出現(xiàn)了長(zhǎng)時(shí)間、大范圍的降水過(guò)程。為研究蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)中δ18O 值與環(huán)境降水量變化的相關(guān)性，本研究從青海省農(nóng)業(yè)墑情檢測(cè)中心收集了2016—2018年青海省油菜蜜主要產(chǎn)區(qū)詳細(xì)降水量數(shù)據(jù)，如圖2-A 所示，2018年各區(qū)域降水量遠(yuǎn)高于往年，最高漲幅達(dá)97%，僅海北低于2017年。與2016年降水量相比，2017年海東、海南降水量較低，其他3個(gè)區(qū)域降水量均高于2016年。青海省年份間總降水量趨勢(shì)為2018年＞2017年＞2016年，與蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)中δ18O 值(圖1)的年際變化呈相反趨勢(shì)。由圖2-B、C、D 可知，各區(qū)域全年80%的降水都集中在5—9月，均在7—8月達(dá)到峰值，尤其從2016年海西的降水量曲線可以明確看出趨勢(shì)，其8月降水量占當(dāng)?shù)厝杲邓康?5%。7—8月正是青海省油菜花盛開(kāi)時(shí)節(jié)，也是采集油菜蜜的時(shí)期，因此本研究主要針對(duì)7—8月降水量數(shù)據(jù)與蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ18O 值進(jìn)行相關(guān)分析。

結(jié)合2016—2018年青海省油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ18O值與降水量數(shù)據(jù)作相關(guān)性分析，縱坐標(biāo)為3年油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ18O 的平均值，橫坐標(biāo)為3年主要采樣區(qū)7—8月降水量的平均值，得到擬合方程y＝-0．035 6x+17．182 0(R2＝0．675 3)(圖3)。經(jīng)Person 相關(guān)性雙變量分析，青海省油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ18O 值與降水量變化相關(guān)性為0．822，說(shuō)明兩者在雙側(cè)水平上顯著負(fù)相關(guān)(P＝0．045＜0．05)。

2.4 油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素比率的地域差異

對(duì)青海省各主要產(chǎn)地(西寧、海南、海西、海東、海北)的蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)穩(wěn)定同位素比值進(jìn)行均值差異性分析(圖4)。5 個(gè)產(chǎn)地樣品的δ13C、δ15N 值之間無(wú)顯著差異(P＝0．142 和0．354，＞0．05)。西寧和海東的δ13C值略高于其他區(qū)域，而δ15N 值略低于其他區(qū)域。δ13C值最低的是海南，δ15N 值最高的是海北。5 個(gè)產(chǎn)地樣品的δ2H、δ18O 值之間存在極顯著差異(P＝0．001 和0．000，＜0．01)。西寧樣品的δ2H 值顯著高于海南、海西，海西樣品的δ2H 顯著低于西寧、海東、海北。海西樣品的δ18O 值顯著高于其他4 個(gè)區(qū)域。

圖2 2016-2018年青海省主要區(qū)域降水量變化Fig.2 Precipitation changes in major areas of Qinghai province from 2016 to 2018

圖3 青海省油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ18O值與降水量的相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis between δ18O value and precipitation in Qinghai province

由圖2-A 可知，2016年青海省西寧、海東、海北、海南、海西地區(qū)年降水量分別為444．1、396．7、402．8、464．2、248．9 mm，表現(xiàn)為海南＞西寧＞海北＞海東＞海西；2017年5 個(gè)區(qū)域年降水量分別為464．0、249．4、517．0、353．4、300．0 mm，表現(xiàn)為海北＞西寧＞海南＞海西＞海東；2018年5 個(gè)區(qū)域年降水量分別為518．3、490．3、442．6、522．3、396．3 mm，表現(xiàn)為海南＞西寧＞海東＞海北＞海西。3年間海西的年降水量均遠(yuǎn)低于5 個(gè)區(qū)域年降水量的平均值。從青海省3年降水量數(shù)據(jù)排序可知，海西降水量數(shù)據(jù)偏低，結(jié)合上文得出的油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ18O 值與降水量高度負(fù)相關(guān)的結(jié)論，降水量偏低正是造成海西蜂蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ18O 值顯著高于其他4 個(gè)區(qū)域樣品的原因。

3 討論

圖4 青海省不同區(qū)域(西寧、海南、海西、海東、海北)油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)中穩(wěn)定同位素比值差異Fig.4 Difference of stable isotope ratios of endogenous proteins of rape honey samples collected from different regions of Qinghai province

自然界植物組織中碳穩(wěn)定同位素分餾過(guò)程受多種環(huán)境因子的共同作用，與產(chǎn)地氣溫、海拔、光照強(qiáng)度等息息相關(guān)。如，溫度、光照通過(guò)調(diào)節(jié)植物葉片的氣孔導(dǎo)度、光合作用酶活性等，改變胞間CO2濃度并影響光合作用代謝產(chǎn)物的δ13C 值[35]。此外，空氣中CO2的濃度及其同位素比值也對(duì)植物及其次生代謝物的δ13C值有較大影響[36]。因此，不同產(chǎn)地蜜源植物碳同位素代謝的差異，能夠反饋到蜂蜜中作為其產(chǎn)地溯源的天然指紋。本試驗(yàn)采集的油菜蜜樣品均來(lái)自青海省內(nèi)的不同產(chǎn)區(qū)，油菜蜜及其內(nèi)源蛋白質(zhì)δ13C 值的差異主要由不同區(qū)域間微氣候環(huán)境差異造成。但青海省鄰近的5 個(gè)區(qū)域的海拔、溫度及光照強(qiáng)度等氣候差異不足以引起蜂蜜及其內(nèi)源蛋白質(zhì)δ13C 值的顯著差異。由此表明，青海省油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的δ13C 值非常穩(wěn)定，能作為其產(chǎn)地溯源和摻假鑒別的有效特征指標(biāo)。

植物組織氮穩(wěn)定同位素比值主要受農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中肥料使用情況的影響。豆科類植物在生物固氮過(guò)程中氮的同位素分餾效應(yīng)較小，因此生物固定的氮與大氣中δ15N 值相近。而化學(xué)合成氮肥過(guò)程中也沒(méi)有發(fā)生顯著的氮同位素分餾，因此合成氮肥中δ15N 值也與空氣中δ15N 值接近[37]。前人研究發(fā)現(xiàn)，化肥中15N 的豐度波動(dòng)范圍小，98%的樣品δ15N 值低于4‰，大多數(shù)在-2‰～2‰之間，其平均值僅為0．1‰；而有機(jī)肥制作，經(jīng)過(guò)了堆沃、發(fā)酵、殺蟲(chóng)、滅菌等富集15N 的過(guò)程，其δ15N 值的范圍波動(dòng)較大，在0．2‰ ～36．2‰之間[38]。經(jīng)調(diào)查，青海春油菜主產(chǎn)區(qū)土壤的本底有機(jī)質(zhì)含量較高，施用化肥的戶占比近80%[39]。根據(jù)土壤養(yǎng)分分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，土壤中全氮含量處于很豐富和豐富水平的占76%，全氮含量最低地區(qū)也屬于中等水平，加之氮肥施用量逐年減少[40]，青海省各產(chǎn)區(qū)油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的氮穩(wěn)定同位素比值變化范圍減小，平均為1．6‰，但仍高于空氣中的δ15N 值，且不同區(qū)域之間δ15N 值差異較小。因此，青海省油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)的δ15N 值可為其產(chǎn)地溯源提供真實(shí)的環(huán)境信息。

植物中的氫、氧穩(wěn)定同位素比值不僅與當(dāng)?shù)亟涤昙稗r(nóng)業(yè)灌溉水源的水同位素特征相關(guān)，還受植物蒸騰過(guò)程分餾作用的影響。因此，植物組織干物質(zhì)及分泌物(如花蜜)中的氫、氧同位素除受水分來(lái)源的同位素比值影響外，還與蒸發(fā)、蒸騰及生物同化等過(guò)程的同位素分餾有關(guān)，分餾系數(shù)與環(huán)境因子密切相關(guān)[41]。本研究中油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ18O 值顯示出了對(duì)青海不同產(chǎn)區(qū)蜂蜜較好的產(chǎn)地溯源與鑒別潛力，不同年際、不同產(chǎn)區(qū)的樣品之間具有較大差異，且與降水量密切相關(guān)。油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)δ2H 值在年際間無(wú)顯著差異，但在不同產(chǎn)區(qū)間出現(xiàn)了顯著差異，推測(cè)油菜蜜內(nèi)源蛋白質(zhì)中氫的分餾在受到環(huán)境水影響的同時(shí)，還可能受到其他氣候條件的交互影響，需要進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究采用EA-IRMS 方法測(cè)定油菜蜜總δ13C 值及其內(nèi)源蛋白質(zhì)δ13C、δ15N、δ2H、δ18O 值，并與油菜蜜產(chǎn)地、年份、降水量等因子進(jìn)行相關(guān)分析。由于區(qū)域內(nèi)微氣候環(huán)境之間差異較小，油菜蜜內(nèi)源蛋白δ13C、δ15N值在不同年份和產(chǎn)地間均無(wú)顯著差異，油菜蜜內(nèi)源蛋白δ18O 值與生產(chǎn)季節(jié)降水量相關(guān)性較高(R2＝0．675 3)， 且具有一定的地域指示性特征。但由于油菜蜜采集點(diǎn)較分散，空間上與降水量數(shù)據(jù)測(cè)量點(diǎn)存在錯(cuò)位，會(huì)影響研究結(jié)果的精確性。當(dāng)前對(duì)植物-花蜜-動(dòng)物-氣候生態(tài)系統(tǒng)中氫、氧的內(nèi)在分餾機(jī)制研究相當(dāng)缺乏，因此，蜂蜜中內(nèi)源蛋白質(zhì)δ2H 值如何響應(yīng)氣候環(huán)境的變化及對(duì)產(chǎn)地溯源的影響還有待深入研究。