鰹魚蒸煮液美拉德反應優化及氨基酸分析

陳啟航 方旭波 陳小娥 池海波 余 輝 田 方 王堅強

(1浙江海洋大學食品與藥學學院，浙江 舟山 316022； 2 浙江國際海運職業技術學院， 浙江 舟山 316021；3 浙江融創食品工業有限公司，浙江 舟山 316000)

鰹魚(Katsuwonus pelamis)俗稱炸彈魚，是一種具有較高經濟效益的金槍魚，其產量約占世界主要金槍魚總產量的48%，低脂肪且富含蛋白質[1-3]。在日本，以鰹魚食材為原料的調味品深受廣大消費者的青睞[4]。在我國，鰹魚魚柳和罐頭加工行業剛起步，其加工副產物鰹魚蒸煮液，營養豐富，富含水溶性蛋白質、多肽等成分，但尚未得到有效利用，主要是由于其腥味較重，消費者不易接受。美拉德反應指食品體系中含氨基化合物與含羰基化合物之間發生的非酶促反應，能使食品產生愉快的香味和誘人的色澤[5-6]。在食品生產中將酶解技術和脫腥工藝相結合，并利用美拉德反應賦予產品獨特的香味和良好的色澤，既能解決鰹魚蒸煮液腥味重的問題，也能為后續開發新型的鰹魚調味料提供研究基礎。

目前，調味料的風味優劣大多直接通過感官評價進行判定，易受測評人員的個人喜好影響，存在一定的主觀性和局限性[7]。電子鼻技術是通過傳感器陣列的響應曲線來分析樣品的揮發性氣味，不僅可以識別各種不同的氣味，而且可對被測樣品中的成分進行定性分析，測定結果比感官評價更客觀，已在食品風味表征中得到廣泛應用[8-9]。周明珠等[10]利用電子鼻對不同保壓時間條件下的鱸魚氣味進行區分，發現不同保壓時間對鱸魚氣味影響不顯著；蒙萬隆等[11]應用電子鼻技術檢測豬肉的揮發性氣味，能夠預測不同肥瘦配比豬肉的新鮮度；苗鈺湘等[12]利用電子鼻技術檢測不同貯藏時間下三疣梭子蟹肉的氣味變化，從而建立了測定三疣梭子蟹鮮度的方法。而利用電子鼻評價鰹魚蒸煮液在美拉德反應條件下產生的風味變化鮮有報道。

本試驗以經木瓜蛋白酶水解后的鰹魚酶解液為原料，利用美拉德反應對酶解液進行呈色和增香，以感官評價和褐變程度為指標，考察不同木糖和葡萄糖配比、加熱時間、溫度和pH 值對美拉德反應的影響，同時采用電子鼻技術結合主成分分析(principal component analysis，PCA)和線性判別分析(linear discriminant analysis， LDA)優化美拉德反應條件[13-14]，并對優化條件下的反應產物進行氨基酸組成成分分析和必需氨基酸營養評價，以期為鰹魚蒸煮液的高值化應用提供一定的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

-20℃貯存的鰹魚蒸煮液，蛋白質含量為3．71%，浙江融創食品工業有限公司；木瓜蛋白酶(1 ×105U.g-1)，南寧龐博生物工程有限公司；安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；D-木糖、D-葡萄糖，安徽酷爾生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

HHS 型電熱恒溫水浴鍋，上海棱光技術有限公司；TGL-16C 低速大容量離心機，軍事醫學科學院實驗儀器廠；PEN3 型便攜式電子鼻，德國Airsense 公司；UV-5900 紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；YXQ-LS-50G 壓力蒸汽滅菌器，上海科曉科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1．3．1 工藝流程 鰹魚蒸煮液→酶解→滅酶→離心→酵母脫腥→美拉德反應→濃縮→成品。

1．3．2 工藝要點 參照文獻[3]制備鰹魚酶解液，酵母發酵脫腥處理條件：0．75%的酵母添加量、在35℃條件下發酵60 min。

1．3．3 鰹魚酶解液美拉德反應單因素試驗 以添加還原糖1．0 g(木糖-葡萄糖配比分別為1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1， m ∶m)、溫度(100、105、110、115、120℃)、反應時間(30、40、50、60、70 min)、pH 值(5、6、7、8、9)作為單因素，研究不同因素對鰹魚酶解液美拉德反應產物的影響，其余各因素設定溫度110℃、加熱時間40 min、還原糖配比2 ∶1(m ∶m)、pH 值7．0，每組各做3次平行，以此確定美拉德反應的最優工藝條件，并對鰹魚酶解液美拉德產物進行電子鼻分析[7]。

1．3．4 鰹魚酶解液美拉德反應條件優化 在單因素試驗的基礎上，選取對鰹魚酶解液美拉德反應影響較大的3個單因素，進行正交試驗。正交試驗設計及水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1．3．5 感官評定 選擇10 名食品專業的學生，針對鰹魚酶解液美拉德反應產物，以滋味、色澤、氣味、形態四項指標作為評價標準，對其進行感官評定，總分40 分，其中氣味、形態、滋味、色澤各10 分，分值越大，說明產物產生的風味越好，結果是剔除異常數再取平均值，評分標準如表2 所示。

表2 美拉德反應產物感官評價表Table 2 The sensory evaluation table of Maillard reaction products

1．3．6 褐變程度測定 按文獻[15]的方法，將鰹魚酶解液稀釋25 倍后，于420 nm 波長處測定其產物的吸光度值，吸光度值即表示褐變程度。

1．3．7 電子鼻分析 將20 mL 鰹魚酶解液美拉德反應產物置于離心管中，密封，室溫下靜置40 min，進行電子鼻檢測分析[16]，每組做3 個平行。通過電子鼻的WinMuster 軟件，對采集到的樣品氣味信息進行PCA 和LDA[17]。

1．3．8 氨基酸營養評價 對美拉德反應優化后的產物進行氨基酸營養評價，參照王念民等[18]的方法計算氨基酸評分(amino acid score，AAS)和必需氨基酸指數(essential amino acid index，EAAI)，參照雷錦桂等[19]的方法計算氨基酸比值系數(ratio coefficient，RC)。氨基酸的測定： 色氨酸采用可見分光光度計法進行測定[20]，其余17 種氨基酸利用氨基酸自動分析儀分析[21]。

1.4 數據分析

所有試驗重復3 次。采用Origin Pro 8．5 軟件繪圖，SPSS 18．0 軟件進行正交試驗分析。

2 結果與分析

2.1 鰹魚酶解液美拉德工藝優化單因素試驗

2．1．1 木糖-葡萄糖配比對鰹魚酶解液美拉德反應的影響 還原糖是參與美拉德反應的重要物質，不同的還原糖種類會使美拉德反應產生不同的風味，其中核糖、木糖、葡萄糖與氨基酸發生美拉德反應產生的風味良好，但核糖的價格相對較貴，而木糖、葡萄糖廉價可行，操作簡單[22]，所以本試驗選擇葡萄糖和木糖。由圖1-A 和1-B 可知，當木糖-葡萄糖配比為1 ∶2時，鰹魚酶解液美拉德反應產物的褐變程度最大，吸光度在420 nm 處達到最大值(0．676)，同時，感官評分也達到最高值(33．5 分)。由圖1-C 可知，第一主成分(PC1)和第二主成分(PC2)貢獻率分別為98．54%和0．93%，主成分貢獻率之和為99．47%，說明主成分可以代表不同木糖-葡萄糖配比鰹魚酶解液美拉德反應產物揮發性氣味的主要特征信息。木糖-葡萄糖配比為1 ∶1、1 ∶2和2 ∶1條件下的橢圓位置接近，區分效果不明顯，需要進行進一步區分。由圖1-D 可知，PC1 和PC2 的貢獻率分別為98．80%和1．03%，兩者累計貢獻率為99．83%。橢圓位置互不重疊，區分程度明顯，說明LDA 能夠很好地區分不同木糖-葡萄糖配比條件下鰹魚酶解液美拉德反應產物的揮發性風味，區分度優于PCA。此外，LDA 中，當木糖-葡萄糖配比為1 ∶2時，橢圓與其他橢圓位置最遠，說明該條件下鰹魚酶解液美拉德反應產物品質較優。綜上所述，選擇木糖-葡萄糖配比為1 ∶2進行正交優化試驗。

圖1 還原糖配比對鰹魚酶解液美拉德反應的影響分析Fig.1 Effect of reducing sugar ratio on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2．1．2 溫度對鰹魚酶解液美拉德反應的影響 由圖2-A 和2-B 可知，溫度低于11℃時鰹魚酶解液美拉德反應隨著溫度的不斷升高，褐變程度也隨之增加，香味物質不斷積累，感官評分也隨之增加；110℃后，溫度變化對褐變程度影響較小，且感官評分隨著溫度的升高而略有降低。由圖2-C 可知，PC1 和PC2 貢獻率分別為97．85%和1．43%。其中，105℃和115℃之間相距較近，區分效果不太明顯，需進一步區分。由圖2-D 可知，PC1 貢獻率為66．07%，PC2 的貢獻率為33．39%，兩者貢獻率之和為99．46%，且橢圓位置互不重疊，說明不同溫度條件下的美拉德反應產物的風味通過LDA 能夠進行較好地區分。通過圖2-D 橫縱坐標，結合圖2-A 和2-B 可知，100℃和120℃的橢圓位置與110、115 和105℃的橢圓位置有較大間距，可能是由于溫度過高或過低的影響。綜上所述，選擇溫度為110℃進行正交優化試驗。這與劉安軍等[23]的研究結果相似。

圖2 溫度對鰹魚酶解液美拉德反應的影響分析Fig.2 Effect of temperature on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2．1．3 反應時間對鰹魚酶解液美拉德反應的影響 如圖3-A、B 所示，反應前期，隨著鰹魚酶解液美拉德反應時間的延長，褐變程度逐漸增加，香味物質也隨之產生。感官評分也隨著反應的進行隨之增加；反應過程中，由于葡萄糖和木糖不斷被消耗，褐變程度增加逐漸減緩；當反應時間超過40 min 后，美拉德產物會產生一定的焦糊味和其他異味，因此感官評分也逐漸降低。由圖3-C 可知，PC1 和PC2 貢獻率分別為91．67%和5．40%。50 和60 min 的橢圓位置存在部分重疊，表明有相似揮發性成分，區分程度不太明顯。由圖3-D 可知，PC1 和PC2 的貢獻率分別為95．03%和3．48%，兩者累計貢獻率為98．51%，且有各自的區域范圍，無重疊交叉，區分程度高。通過圖3-D 橫縱坐標比較，結合圖3-B 可知，當時間達到40 min 后，隨著時間的延長，感官評分逐漸降低。因此，選擇反應時間為40 min 進行正交優化試驗。這與王玉芬等[24]的研究結果相似。

2．1．4 pH 值對鰹魚酶解液美拉德反應的影響 由圖4-A、B 可知，pH 值增大會加快鰹魚酶解液美拉德反應進程，當pH 值為7 時，在420 nm 波長處的吸光度值為0．696，達到最大值，感官評分為31．6 分。由圖4-C可知，PC1 和PC2 貢獻率分別為77．73%和16．79%，總貢獻率為94．52%。pH 值7．0 和8．0 處的橢圓位置存在交叉，說明存在相似的揮發性成分，需進一步區分。由圖4-D 可知，PC1 和PC2 的貢獻率分別為89．20%和9．17%，兩者累計貢獻率為98．37%，且橢圓位置互不重疊，說明能夠對不同pH 值條件下的鰹魚酶解液美拉德產物風味進行良好區分。結合圖4-A、B可得，pH 值過高或過低，都會影響香氣成分。因此，選擇pH 值為7。

圖3 反應時間對鰹魚酶解液美拉德反應的影響Fig.3 Effect of reaction time on Maillard reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

2.2 鰹魚酶解液美拉德工藝優化正交試驗

根據單因素試驗結果可知，木糖-葡萄糖配比(A)、溫度(B)以及反應時間(C)對鰹魚酶解液美拉德反應影響較大。由表3 可知，就褐變程度而言，各因素對鰹魚酶解液美拉德反應影響的大小順序為A＞B＞C；由感官評分可知，各因素對美拉德反應影響大小的順序為A＞C＞B。綜合木糖-葡萄糖配比、溫度、反應時間3 個因素對美拉德反應產物的影響，得出美拉德工藝最佳條件為A2B2C3，即木糖-葡萄糖配比為1 ∶2，溫度110℃，時間45 min，在此基礎上進行了驗證試驗，試驗平行3 次，結果表明，褐變程度A420分別為0．631、0．626、0．634，平均值為0．630，感官評分分別為34．7、35．0、35．1 分，平均值為34．9 分，其中感官評分高于表3 中的任一數據，說明正交試驗得到的美拉德工藝優化參數具有適用性和可靠性。所得產物魚香味濃郁、口感細膩，色澤為黃棕色。

2.3 游離氨基酸組成成分分析及相關營養評價

由表4 可知，鰹魚酶解液美拉德產物中存在18 種氨基酸，氨基酸種類齊全，與鰹魚酶解液相比，其氨基酸含量減少較明顯的主要有苯丙氨酸(36．76%，減少百分比，下同)、組氨酸(31．07%)、半胱氨酸(25．72%)、絲氨酸(15．93%)，說明這幾種氨基酸是參與該美拉德反應產香味的主要氨基酸。另外，美拉德產物中呈味氨基酸豐富，其中甘氨酸含量較多。

由表5 可知，當以AAS 為標準時，鰹魚酶解液美拉德產物中色氨酸評分最高，其次為蛋氨酸+半胱氨酸；以RC 為標準時，氨基酸最小值為第一限制性氨基酸[25]，鰹魚酶解液美拉德產物的亮氨酸的RC 值最小，因此亮氨酸為第一限制性氨基酸。EAAI 是一項營養指標，常用來評價蛋白質營養價值[26]，鰹魚酶解液美拉德產物的EAAI 為64．034，表明其營養價值豐富，是理想的調味基料，值得進一步研究開發利用。

3 討論

圖4 pH 值對鰹魚酶解液美拉德反應的影響Fig.4 Effect of pH value on Maillard Reaction of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

表3 鰹魚酶解液美拉德工藝優化正交試驗結果Table 3 Orthogonal experiment results of Maillard reaction optimization for Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

表4 氨基酸組成分析Table 4 Analysis of amino acid composition /(g·100g-1)

表5 鰹魚酶解液美拉德反應產物必需氨基酸營養評價Table 5 Nutritional evaluation of essential amino acids in Maillard reaction products of Skipjack tuna enzymatic hydrolyzate

美拉德反應是指羰基化合物的羰基和氨基化合物的氨基之間發生的復雜反應，因其反應產物能對食品的風味產生至關重要的影響，已廣泛應用于海鮮調味料的制備。李學鵬等[27]通過美拉德反應改善四角蛤蜊酶解液風味，所得產物具有濃郁的鮮香味。郭福軍等[28]研究了美拉德反應對河蚌酶解液風味的影響，結果表明，美拉德反應使河蚌肉酶解液肉香味濃郁。由于鰹魚蒸煮液本身腥味很重，加上酶解過程中脂質的氧化降解以及蛋白質降解，使得鰹魚酶解液的腥味也較重，影響食用。本研究結果表明，木糖-葡萄糖配比、溫度、反應時間3 個因素對美拉德反應影響較大，通過優化美拉德反應，可將鰹魚蒸煮液制成鮮味佳且含有豐富游離氨基酸的海鮮調味料。

采用PCA 和LDA 方法分析電子鼻數據能夠區分樣品間的差異性，已經逐步應用于食品工業等領域。李迎楠等[29]采用電子鼻技術結合PCA 和LDA 檢測不同反應溫度對牛肉風味品質的影響，結果表明，不同溫度條件下肉味香精差異顯著。馮敏等[30]采用電子鼻技術結合PCA 和LDA 檢測輻照肉鴨產品中揮發性風味物質的變化，結果表明，經輻照處理后樣品的揮發性風味物質的響應值均發生了變化。本研究在感官評價的基礎上，采用電子鼻技術結合LDA 能夠更有效地區分樣品間的差異性，并得出最優美拉德反應條件。后續研究將結合氣質色譜聯用儀(gas chromatographymass spectrometer， GC-MS)對其揮發性物質進行深入研究。

美拉德反應較為復雜，研究人員大多對此類美拉德反應前后產物氨基酸成分進行研究，獲得少量特定的氨基酸與糖進行美拉德反應的產物的特征。氨基酸(尤其是游離氨基酸)對海鮮調味基料的呈味起著重要的作用。張慧芳等[31]在對魷魚內臟水解液美拉德反應前后氨基酸分析時發現，魷魚內臟水解液美拉德反應后產物組氨酸、脯氨酸、精氨酸、苯丙氨酸4 種氨基酸減少比例較明顯，是參與美拉德反應的主要氨基酸。童彥等[32]分析鳙魚蛋白水解液美拉德反應前后氨基酸時發現，蛋白水解液美拉德產物中精氨酸、賴氨酸和酪氨酸減少較明顯，是參與美拉德反應的主要氨基酸。本研究發現，鰹魚酶解液經美拉德反應后，其氨基酸含量有一定程度的下降，苯丙氨酸、組氨酸、半胱氨酸和絲氨酸相對于其他氨基酸減少較明顯，說明這4 種氨基酸可能是參與該美拉德反應的主要氨基酸。其中反應產物的必需氨基酸總含量較高，具有良好的營養性。另外，鰹魚酶解液美拉德產物的氨基酸組成豐富，共檢測出18 種氨基酸。其中，谷氨酸、甘氨酸和天冬氨酸相對含量較高，谷氨酸和天冬氨酸為鮮味氨基酸，甘氨酸為甜味氨基酸，能使海鮮調味料香氣濃郁，這對利用鰹魚酶解液進行美拉德反應制備海鮮調味料有重要的意義。

4 結論

本研究通過單因素試驗對鰹魚酶解液美拉德反應影響因素進行研究，結果表明，木糖-葡萄糖配比、溫度及反應時間對鰹魚酶解液美拉德反應影響較大。在單因素試驗的基礎上，結合正交試驗得到鰹魚酶解液的最佳美拉德條件為木糖-葡萄糖配比1 ∶2、溫度110℃、反應時間45 min，此時美拉德反應產物的吸光度值為0．630，感官評分為34．9 分。氨基酸組成成分分析發現，美拉德產物中共檢出18 種氨基酸，呈味氨基酸含量豐富。本研究為鰹魚酶解液的高值化利用提供了一種新的思路，對開發鰹魚風味食品具有指導意義。