殼聚糖酶解產物抑制真菌活性研究

王軍華 趙雙枝 陳相艷 張彥昊 辛 雪 張 翔 陳蕾蕾

(山東省農業科學院農產品研究所/山東省農產品精深加工技術重點實驗室/農業農村部新食品資源加工重點實驗室，山東 濟南 250100)

隨著社會的進步和生活水平的提高，人們對食品安全提出了更高的要求，然而，目前食品工業中常用的防腐劑主要為化學防腐劑，因其濫用引發的食物中毒事件頻發，也使得尋找安全、高效、綠色、低毒的生物防腐保鮮劑已成為近幾年的研究熱點[1]。殼聚糖是一種天然高分子聚合物，除具有廣譜抑菌性，還具有良好的生物相容性、低毒性、低抗敏性及可降解性等[2-3]。研究表明，采用殼聚糖處理采后果蔬，能在抑制病原菌侵染果實的同時，誘導果蔬產生抗性[4]，有效提高櫻桃番茄[5-6]、砂糖橘[7]、草莓[8]、臍橙[9]、蘋果梨[10]、冬棗[11]等果實的貯藏品質；殼聚糖處理番茄幼苗可以提高番茄幼苗的光合利用率以及保護酶活性，從而提高番茄幼苗對灰霉病的抗性[12]。此外，殼聚糖涂膜處理可抑制魚類等水產品的菌落增長[13]。表明殼聚糖具有發展成為高效生物防腐保鮮劑的潛力。

本試驗前期研究過程中發現，市售殼聚糖經酶解后，酶解產物對真菌的抑制活性顯著提高。而且有研究顯示，殼聚糖經酶解后得到低分子量殼聚糖，其抑菌活性顯著提高[14]。因此，本試驗擬對殼聚糖酶解產物的抑制真菌活性進行研究，旨在為推進殼聚糖在防腐保鮮方面的應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

殼聚糖，上海生工生物工程股份有限公司；殼聚糖酶，自制，由菌株ncps116 的發酵上清液，經硫酸銨沉淀、50 mmol.L-1磷酸鹽緩沖溶液(pH 值7．5)復溶并透析，酶的發酵、制備、理化性質以及活力測定按文獻[15]所述；氨基葡萄糖鹽酸鹽標準品，上海源葉生物科技有限公司；1 mg.mL-1碘化丙啶(propidium iodide，PI)溶液，大連美侖生物技術有限公司；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(potato dextrose agar，PDA)，青島海博生物科技有限公司；其他化學試劑均為市售分析純。

1.2 主要儀器與設備

OLYMPUS IX71 倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；ZEISS Sigma 300 場發射掃描電子顯微鏡，德國卡爾.蔡司股份公司。

1.3 試驗方法

1．3．1 殼聚糖酶解產物制備 將殼聚糖溶于1%冰醋酸中，制成2%(w/v)的殼聚糖溶液，按5 U.g-1的比例加入殼聚糖酶溶液，在50℃、180 r.min-1條件下進行酶解試驗，收集不同酶解時間(0、0．5、1、1．5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 和24 h)西瓜專化型尖孢鐮刀真菌的酶解產物，沸水浴15 min 滅活，10 000 r.min-1離心2 min 后，取上清液凍干得殼聚糖酶解產物的凍干粉末，備用。

1．3．2 殼聚糖酶解產物中還原糖濃度測定 參考文獻[16]，采用3，5-二硝基水楊酸(3，5-dinitrosalicylic acid， DNS)法測定。準確稱取氨基葡萄糖鹽酸鹽標準品，加蒸餾水配制成濃度分別為0．065、0．130、0．260、0．520、1．040、2．080、3．320、4．150、6．640 mg.mL-1的氨基葡萄糖溶液。分別吸取4 mL 氨基葡萄糖溶液，以蒸餾水為空白，加入3 mL DNS 試劑，沸水浴加熱5 min，冷卻后定容至10 mL，搖勻后測定540 nm 波長處的吸光度值，繪制標準曲線。取凍干粉末，加蒸餾水配制成1%的待測溶液，取4 mL 待測溶液，按照上述方法定容后，于11 000 r.min-1離心2 min，取上清液測定540 nm 波長處的吸光度值，以蒸餾水為空白，根據標準曲線計算樣品中的還原糖濃度。

1．3．3 殼聚糖酶解產物真菌抑制試驗 取病原菌菌塊，接種于PDA 平板，28℃培養3 d 后，從病原菌菌絲邊緣制取直徑5 mm 菌塊，用無菌刀切碎后混懸于400 μL無菌水中，取50 μL 菌懸液涂布于PDA 平板上(平板中含有30 μg.mL-1的氯霉素)。在平板上打孔，孔直徑9 mm，孔間距不小于4 cm，每個孔中加入150 μL 待測樣品，28℃培養48 h，采用十字交叉法測定抑菌圈直徑。

1．3．4 pH 值對殼聚糖酶解產物抑菌性能的影響 取酶解時間為6 h 的酶解液凍干粉末加蒸餾水溶解至濃度為1%，調節pH 值分別為4．0、4．7、5．4、6．0、6．5 和7．0，以西瓜專化型尖孢鐮刀菌為指示菌按照上述真菌抑制試驗培養48 h，測定抑菌圈直徑，以相應pH 值的0．2 mol.L-1醋酸-醋酸鈉緩沖溶液為空白對照。

1．3．5 殼聚糖酶解產物對孢子萌發的影響 制備新鮮的西瓜枯萎病菌孢子懸液，無菌水調整孢子個數為106個.mL-1。吸取500 μL 孢子懸液至10 mL 殼聚糖6 h 酶解液(含濃度2%葡萄糖)中，酶解液濃度分別為0．1%和1．0%，28℃、150 r.min-1條件下避光培養12 h，11 000 r.min-1離心10 min 后收集孢子，蒸餾水洗滌2 次，加入990 μL 蒸餾水重懸孢子，加入10 μL PI 溶液，混勻后在黑暗中靜置15 min，在倒置熒光顯微鏡下觀察、拍照。

1．3．6 掃描電鏡觀察殼聚糖酶解產物對真菌菌絲的影響 取西瓜專化型尖孢鐮刀菌抑菌圈邊界處的菌絲置于2%預冷戊二醛中，于4℃條件下固定，樣品的脫水、干燥和鍍膜由山東微亞生物技術有限公司完成，在掃描電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 數據處理

使用Excel 2010 軟件進行數據統計分析；使用SPSS 22．0 軟件的Duncan 法進行顯著性分析，P＜0．05為差異顯著，P＞0．05 為差異不顯著，方差分析結果均以平均值±標準偏差(mean±SD)表示。

此外，每一中不同的用地類型有著不同的生境適宜性，對受生態威脅的敏感程度也不同，綜合眾多研究成果[26-27]的基礎上，結合研究區域生態環境的具體情況，將土地利用類型分為人工地類、自然地類兩大類，分別賦值0（人工）、1（自然），從人工地類到自然地類，敏感性由低到高，其取值范圍為0-1，0表示不敏感，1表示高度敏感性。本文對應的地類對各威脅因子的敏感度具體如表2所示。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖酶解產物對病原真菌的抑制活性

圖1 不同酶解時間的殼聚糖酶解產物(1%)對棉花黃萎病菌的抑制活性Fig.1 The inhibitory activities of chitosan hydrolysates at a concentration of 1%at different digestion time toVerticillium dahliae

使用殼聚糖酶對市售殼聚糖進行酶解，以棉花黃萎病菌為病原指示菌，抑菌結果顯示(圖1)，整個酶解期間，抑菌活性呈先升高后降低的趨勢。酶解0．5 h時，抑菌活性顯著升高，酶解0．5 ～2 h 期間，抑菌活性無顯著變化，之后呈線性提高，在酶解6 h 時達到最大，之后緩慢降低；酶解12 h 內，酶解產物對棉花黃萎病菌的抑制活性均較未經酶解的殼聚糖顯著增強，直至24 h 時，酶解較為完全，抑菌活性低于未經酶解的殼聚糖。殼聚糖酶能夠專一催化水解殼聚糖中的糖苷鍵，生成低分子量殼聚糖，酶解程度不同，其抑菌活性存在差異，然而殼聚糖抑制真菌活性與分子量相關[17]，分子量降低減少了殼聚糖分子間作用，有利于殼聚糖與細胞壁的脂質雙層和陰離子脂質的靜電和疏水締合，增強殼聚糖與真菌細胞膜的結合[18]。

為深入驗證殼聚糖酶解產物對植物病原菌的抑制活性均有改善，測定抑菌活性提高最顯著的6 h 酶解產物對3 種病原真菌的最低抑菌活性，結果顯示(表1)，市售殼聚糖對3 種病原菌的最低抑菌濃度在0．500% ～1．000%，而6 h酶解產物為0．125% ～0．250%，最低抑菌活性提高了4～8 倍。

表1 殼聚糖及酶解產物的抑菌效果Table 1 The inhibitory activities of the chitosan and chitosan hydrolysate

2.2 殼聚糖酶解產物中還原糖濃度分析

殼聚糖經酶解后，暴露出還原端，分子內的自由醛基與DNS 發生氧化還原反應，生成紅棕色的3-氨基-5-硝基水楊酸[19]。經測定氨基葡萄糖濃度在0．13 ～2．00 mg.mL-1范圍內，OD540(y)與濃度(x)呈線性相關(y＝1．264 7x- 0．093 9，r＝0．997 6)，還原糖濃度高低可反映殼聚糖的酶解水平。

由圖2 可知，隨著酶解的進行，酶解產物中的還原糖濃度總體逐漸增加，酶解0．5 h 時還原糖濃度為44．24 μg.mL-1，與未經酶解的市售殼聚糖相比，其抑菌活性顯著提高(圖1)，表明用酶解反應提高市售殼聚糖的抑菌活性是可行的；隨后還原糖濃度呈增加趨勢，至酶解9 h 時達到571．79 μg.mL-1，酶解9 ～12 h期間，還原糖濃度變化平穩，酶解24 h 產物的還原糖濃度迅速增大為酶解12 h 產物的3 倍，表明酶解反應一直在進行。此外，酶解1 ～12 h 產物的抑菌活性呈現先升高后降低的趨勢，其中酶解6 h 產物的抑菌活性最強，此時還原糖濃度為383．34 μg.mL-1，與酶解0～1 h 產物中的還原糖濃度存在顯著差異(P＜0．05)，與酶解12 h 內其他產物中的還原糖濃度無顯著差異(P＞0．05)；而酶解24 h 產物的還原糖濃度較酶解6 h產物顯著提高，但其抑菌活性顯著降低(P＜0．05)。同時，DNS 法測定還原糖濃度的過程中發現，氧化還原過程中，酶解0～12 h 的酶解產物中均有沉淀出現，而酶解24 h 的產物無沉淀析出，表明此時已酶解充分，推測主要成分為溶解性較好的殼寡糖。而酶解24 h產物對棉花黃萎病菌的抑制活性顯著降低，甚至低于未經酶解的殼聚糖，表明并非酶解越充分，抑制活性越好。因此，酶解過程中可通過控制還原糖濃度，并結合抑菌活性，實時監測酶解過程，以防酶解不足或過度水解，影響水解液的抑制真菌效果。

圖2 不同酶解時間殼聚糖酶解產物(1.0%)中的還原糖濃度Fig.2 The reducing sugar content of chitosan hydrolysates at a concentration of 1.0%at different digestion time

2.3 pH 值對殼聚糖酶解產物抑制真菌活性的影響

以活性提高最顯著的酶解6 h 產物為研究對象，考查pH 值對殼聚糖酶解產物抑制真菌活性的影響。由圖3 可知，pH 值在4～7 范圍內(初始pH 值4．7)對病原真菌西瓜專化型尖孢鐮刀菌都有抑制作用，但不同pH 條件下，抑菌活性存在顯著差異。當pH 值＞5．4時，酶解6 h產物的抑菌圈直徑較初pH 值顯著減小，隨著pH 值的持續增加，抑菌圈發生不同程度的減小，當pH 值達到7．0 時，抑菌圈直徑最小。目前普遍認為，低pH 值條件下，殼聚糖氨基經質子化，所帶正電荷與細胞表面的蛋白質或磷脂相互作用增強，影響細胞膜結構[8，20]，質子化殼聚糖也會進入菌體胞內，吸附結合部分帶負電的細胞質，擾亂菌體細胞的正常生理代謝[21-22]；而當pH 值持續升高，正電荷的比例降低，細胞膜表面結合作用以及細胞質吸附作用就變差；此外，pH 值升高還導致殼聚糖酶解產物的溶解性變差[23]，最終導致抑菌活性降低。因此，在殼聚糖酶解產物應用過程中，酸性條件有利于殼聚糖酶解產物質子化，更有利于發揮其對真菌的抑制活性。也確有研究證實，殼聚糖水解液在酸性環境下對耐藥性大腸桿菌的抑制作用顯著[22]，馬海賓等[24]也發現低分子量殼聚糖在pH 值5．5～6．5 時抑制病原菌效果最佳。

圖3 不同pH 值下殼聚糖酶解6 h 產物(1.0%)對西瓜枯萎病菌的抑菌作用Fig.3 The inhibitory activities of chitosan hydrolysate at 6 h (1.0%)with different pH value to F. oxysporum f.sp. niveum

2.4 殼聚糖酶解產物對孢子的作用

Plascencia-Jatomea 等[25]研究發現殼聚糖溶液會延遲黑曲霉孢子休眠期，影響孢子極化和芽管形成，并產生孢子聚集現象。為研究殼聚糖酶解產物是否也對真菌孢子有抑制作用，在熒光顯微鏡下觀察不同處理對孢子萌發的影響(圖4)，相較于未處理孢子，0．1%殼聚糖6 h 酶解產物處理的孢子萌發不受影響，但菌絲長度明顯變短，生長緩慢；而1%殼聚糖酶解6 h 產物處理的孢子形狀變長，僅有少數伸出芽管。在熒光顯微鏡下，3 個試驗組結果均為PI 陰性。PI 不能通過活細胞膜，卻能穿過破損的細胞膜，對死細胞進行染色，這表明殼聚糖酶解產物僅能抑制孢子萌發，不能破壞孢子完整性。為驗證這種抑制作用是否只是暫時的，進而將1%殼聚糖酶解產物處理的孢子用蒸餾水洗滌2 次，蒸餾水重懸后，取50 μL 懸液涂布于PDA平板上。12 h 后，對照平板已布滿菌絲(圖5-A)，而處理過的平板無肉眼可見菌落出現(圖5-B)，直至48 h開始出現較小的菌落，生長緩慢(圖5-D)，7 d 后，菌落直徑增加，但菌落數沒有增加(未列圖)。這可能是由于酶解后低分子量的殼聚糖不可逆地結合到孢子表面，抑制了部分孢子的萌發；而對于已經萌發的孢子，沒有足量的殼聚糖與之結合，菌絲的生長不能完全被抑制[25-26]。

圖4 不同濃度殼聚糖6 h 酶解產物對西瓜專化型尖孢鐮刀菌真菌孢子的作用Fig.4 The effect of chitosan hydrolysates at 6 hours with different concentration on spore germination with F. oxysporum as indicator

2.5 掃描電鏡觀察殼聚糖酶解產物對真菌菌絲的影響

圖5 殼聚糖6 h 酶解產物(1.0%)對西瓜專化型尖孢鐮刀菌真菌孢子的作用Fig.5 The F. oxysporum spore germination on plate after being treated with chitosan hydrolysates at 6 hours (1.0%)

真菌抑菌試驗中，0．1%～1．0%殼聚糖酶解6 h 產物均能抑制西瓜專化型尖孢鐮刀菌菌絲生長(表1)，圖5-B 顯示0．1%殼聚糖酶解產物也能抑制孢子萌發生長速度，但PI 陰性表明0．1%酶解產物并不能破壞孢子的膜通透性，也沒能破壞萌發菌絲的膜通透性。上文提及，質子化殼聚糖不可逆的結合到孢子表面，抑制孢子萌發，而對于已萌發的菌絲，沒有酶解產物的結合，未觀察到對菌絲的破壞。為探究該酶解產物對菌絲的作用，采用掃描電鏡觀察1．0%殼聚糖酶解產物對菌絲的影響，結果顯示殼聚糖酶解產物處理過的菌絲，菌絲邊界不清，部分菌絲融合成一片(圖6-A)，表面褶皺、凹凸不平，菌絲斷裂，末端出現囊泡等畸形(圖6-B、C)。

3 討論

殼聚糖分子量與抑菌活性顯著相關[17]，但是活性最強的分子量范圍，仍存在爭議。酶解法降解殼聚糖具有高效、無污染、低成本等優勢[27]，本研究采用自制殼聚糖酶進行酶解，以降低市售殼聚糖分子量，結果發現，隨著酶解進行，酶解產物的抑菌活性呈現先升高后降低的趨勢。理論上，隨著酶解的進行，分子量逐漸降低，說明并非分子量越低，酶解產物對病原真菌的抑制活性越強，而是在酶解6 h 發生了轉折，這與楊冬芝等[28]的研究相似。楊冬芝等[28]關于殼聚糖的研究發現，隨著分子量的增加，抗菌活性先增強后降低，也出

圖6 1.0%殼聚糖6 h 酶解產物對西瓜專化型尖孢鐮刀菌真菌菌絲的影響Fig.6 The effect of chitosan hydrolysates at 6 hours (1.0%) to the F. oxysporum hypha

現了一個分子量的拐點，但是抑菌活性差異并不顯著。而本試驗與之不同的是酶解6 h 的殼聚糖酶解產物，對真菌的抑制活性較其他酶解時間的酶解產物差異顯著(P＜0．05)，除分子量的差異外，這個顯著差異也可能是源于殼聚糖酶解產物未經純化，其組成為分子量不同的殼聚糖，成分復雜，對真菌的抑制作用為多種成分協同作用。

本研究進行酶解反應的pH 值為4．7，無需進一步調節，后處理簡單。進一步研究發現，酶解產物能長期抑制孢子萌發和菌絲生長，殼聚糖酶解產物處理過的菌絲發生斷裂，產生末端囊泡等畸變，初步證實殼聚糖酶解產物能明顯抑制病原真菌。此外，本研究還對殼聚糖酶解產物抑制真菌性質進行了初步探討，相較于純品殼聚糖，酶解0．5～12 h 產物對試驗病原菌的抑制活性均顯著提高，后續研究會深入探討該酶解產物與市售各種分子量的殼聚糖在抑菌活性上是否存在差異，以促進該酶解產物作為生物防腐保鮮劑的發展。

4 結論

本試驗使用自制的殼聚糖酶來酶解殼聚糖，其中酶解6 h 的產物對3 種病原真菌(棉花黃萎病菌、蘋果輪紋病菌、西瓜專化型尖孢鐮刀菌)的最低抑菌活性較未酶解殼聚糖提高了4～8 倍，在pH 值4．0 ～4．7 時西瓜專化型尖孢鐮刀菌抑菌活性最顯著；同時，酶解6 h 的殼聚糖產物能導致西瓜專化型尖孢鐮刀菌真菌菌絲發生形態變化，造成菌絲斷裂、褶皺、菌絲末端囊泡等畸形生長，并長期抑制孢子生長和菌絲伸長，從而有效抑制真菌生長。