銀杏葉渣制肥對小白菜種子萌發及幼苗生長的影響

邵金華 全沁果 張文兵 熊佳萱 文天鳳 楊川川

(1湖南科技學院化學與生物工程學院，湖南 永州 425199；2湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南 永州 425199；3湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室，湖南 永州 425199；4 土傳病害綠色防控湖南省工程研究中心，湖南 永州 425199)

過渡使用化肥會破壞土壤原有的結構和生境，使得蔬菜的養分吸收和運輸發生障礙，導致其產量和品質隨之下降[1]，且化肥中的重金屬元素、硝酸鹽、放射性物質易污染蔬菜，造成食品安全隱患[2]。生物有機肥是以有機固體殘留物為原料，包括有機垃圾、農副產品廢棄物、動物糞便等，經過微生物發酵、去味及腐熟后制得的一類有機肥料[3]。該肥料包含多種植物生長所需的營養元素，并能改善土壤理化性狀及施用化肥造成的土壤板結，增強土壤的保水、供肥、保肥能力[4]。因此，生物有機肥作為化肥的替代品在蔬菜生產中具有廣泛的應用前景。

銀杏葉作為中藥材，由銀杏(Ginkgo bilobaL．)的葉片干燥制得，有效成分主要包括銀杏黃酮醇苷、銀杏萜內酯、銀杏多糖[5]。其黃酮與萜內酯化合物對高血脂癥、冠心病和心絞痛等中老年心血管疾病療效顯著[6]。在生產該中成藥過程中會產生大量銀杏葉殘渣，大部分被直接丟棄，且缺乏回收利用技術，造成了環境污染與資源浪費。本試驗以銀杏葉殘渣為原料，采用單因素-正交試驗優化 EM ( effective microorganisms)菌種發酵制備生物有機肥的工藝條件，分析肥料的品質，并探究以該肥料為配方的水浸液對小白菜種子萌發及幼苗生長的影響，以期為銀杏葉渣的二次開發以及價值提升提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試驗地概況

銀杏葉渣為工業提取黃酮和內酯后得到的殘渣，由湖南恒偉藥業提供，將其烘干后粉碎，密封保存。EM 菌種來源于中國普通微生物管理中心；EM 培養基為南京宏遠生物科技有限公司生產；小白菜種子購自湖南省永州市種子管理站。

試驗地位于湖南科技學院實驗園區(26°12′43．31"N，111°35′48．71"E)，海拔122．45 m，處于溫、熱帶線合部，屬熱帶季風氣候，氣候溫和，雨量充沛，土地肥沃，年降水量1 290 ～1 900 mm，年均日照1 873．7 h，年均無霜期285 ～311 d，年均氣溫17．6 ～18．6℃。土壤有機質含量14．36 g.kg-1、全氮含量0．84 g.kg-1、硝態氮含量573．26 mg.kg-1、銨態氮含量10．64 mg.kg-1、全磷含量0．42 g.kg-1、速效磷含量15．03 mg.kg-1、全鉀含量16．99 g.kg-1、速效鉀含量60．37 mg.kg-1。試驗前風干、磨細、過40 目篩備用。

1.2 試驗設計

1．2．1 EM 菌種的活化 用超純水將EM 培養基稀釋10 倍，將其以50 mL/瓶均勻分裝至250 mL 錐形瓶中，于立式壓力蒸汽滅菌器筒中進行滅菌處理，于室溫自然冷卻至40℃以下備用。在超凈工作臺下用接種環挑取適量EM 菌接種至50 mL 經滅菌的EM培養基中，將錐形瓶口用棉花和報紙包扎緊且混勻后，于37℃恒溫培養箱中以200 r.min-1振蕩培養3 d。培養結束后，于4℃、10 000 r.min-1離心5 min，以無菌生理鹽水充分洗滌后制成約1010CFU.mL-1的菌懸液備用。

1．2．2 制肥工藝的單因素試驗 稱取一定量的銀杏葉渣，置于250 mL 錐形瓶中，依次加入無菌水、葡萄糖，調節pH 值為7．20。放進高壓滅菌鍋中進行滅菌處理，待其自然冷卻至室溫后接入1．2．1 中制得的EM菌懸液1．00 mL，然后在37℃條件下進行恒溫發酵，以腐殖酸含量作為衡量發酵程度的指標。固定初始條件為發酵時間2 d、液料比1 mL.g-1、銀杏葉渣添加量10．00 g、葡萄糖添加量0．50 g，研究發酵時間(2、4、6、8、10 d)、液料比(1．0、1．5、2．0、2．5、3．0 mL.g-1)、銀杏葉渣添加量(10、15、20、25、30 g)、葡萄糖添加量(0．5、1．0、1．5、2．0、2．5 g)的變化對腐殖酸含量的影響。根據公式計算腐殖酸含量[7]：

式中，A1表示空白組消耗的硫酸亞鐵銨標準滴定溶液體積，mL；A2表示樣品消耗的硫酸亞鐵銨標準滴定溶液的體積，mL；C 表示硫酸亞鐵銨標準滴定溶液的體積，mol.L-1；K 表示純腐殖酸中碳的系數，參考泥炭腐殖酸約為0．51；M 為樣品質量，g；A0為風干樣品的含水量，%。

1．2．3 制肥工藝的正交試驗 在單因素試驗的基礎上，以發酵時間、液料比、銀杏葉渣添加量、葡萄糖添加量設置4 因素3 水平正交試驗，根據腐殖酸的含量確定銀杏葉渣制肥的最適發酵參數。隨后對最適發酵參數進行試驗驗證。正交試驗的因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factor and level of orthogonal test

1.3 測定項目與方法

1．3．1 生物有機肥的相關成分測定 銀杏葉渣制肥相關成分的測定按《NY 884-2012 生物有機肥》[8]執行，測定其有效活菌數和有機質含量，以及砷、鎘、鉛、鉻、汞5 種重金屬含量。

1．3．2 種子發芽率的測定 將銀杏葉渣制肥和去離子水制成水浸液等份放入3 個培養皿中，設置0．1、0．2、0．4、0．8、1．6 g.mL-15 個濃度梯度，以去離子水為對照(CK)，將小白菜種子分別于不同濃度水浸液中浸泡8 h 后統一取出。每個發芽床上各放置50 粒種子，然后用鑷子將小白菜種子的腹溝朝下，再將其整齊的排列在發芽床上，以避免相互之間接觸，防止發霉的種子感染健康種子。之后蓋上培養皿蓋，將其置于28±1℃恒溫光照條件下培養3 d。發芽期間每天觀察發芽情況以及發芽床的濕潤情況，并及時補充缺失的水分，以胚根達到或超過種子長度、胚芽達到種子長度1/2判定為發芽，測定根長，根據公式計算種子發芽指數[9]：

1．3．3 幼苗生長測定 設置0．1、0．2、0．4、0．8 g.mL-14 個濃度梯度的銀杏葉渣肥制水浸液，以去離子水為對照(CK)，將其加至瓶底鋪有2 張濾紙的圓柱玻璃瓶中，選取5 顆萌發程度相當的種子放入瓶內，定時補充水浸液，5 d 后分別測定小白菜幼苗的苗長和根長。平行試驗3 次。

1．3．4 根系酶活測定 將1．3．3 中水培5 d 后的小白菜幼苗從培養瓶中取出，轉移過程中注意保護其根部，將根部用超純水洗凈后用吸水紙吸干，加入相應體積提取液，于冰水浴環境下制成組織勻漿。根系脫氫酶活性的測定采用TTC 法[10]，硝酸還原酶活性的測定采用α-萘胺法[11]。

1．3．5 品質指標的測定 取適量1．3．4 中采集的小白菜幼苗，洗凈后于70℃電熱鼓風干燥箱中干燥至恒重備用?？扇苄蕴呛康臏y定采用蒽酮比色法[12]，游離脯氨酸含量的測定采用茚三酮顯色法[13]。

1．3．6 盆栽出苗率及生物量的測定 設置生物有機肥添加量10%為底肥(T1)、氮肥-生物有機肥復合處理為底肥(N 施入量為100 mg.kg-1，生物有機肥添加量為5%，T2)，以不施肥的土壤(CK1)和以氮肥為底肥(N 施入量為200 mg.kg-1，以NH4H2PO4和尿素的形式加入，CK2)的土壤作為對照。每盆裝培養土2 kg，均勻播種50 粒小白菜種子，重復3 次。播種后灑水至土壤濕潤，之后視土壤狀況適時補水。1 周后計算出苗率并間苗，每盆留長勢均勻的小白菜幼苗15 株。20 d 后取樣，將小白菜根部用超純水洗凈后用吸水紙吸干，測定小白菜生物量(包括根鮮重、莖葉鮮重和總鮮重)。

1.4 數據分析

各試驗組均平行3 次，取其平均值。利用Origin 2018 作圖，并用SPSS 19．0 采用Duncan 法進行差異顯著性檢驗(P＜0．05)。

2 結果與分析

2.1 銀杏葉渣制肥的單因素試驗

由圖1-A 可知，初期腐殖酸含量隨著發酵時間的延長而增加，當發酵時間達到6 d 后其含量開始降低。銀杏葉廢渣中的無機鹽和營養物質隨著發酵的進行不斷被釋放，6 d 后已趨于飽和，繼續延長發酵時間腐殖酸會逐漸被代謝分解。因此確定發酵時間6 d 附近為正交試驗研究區間。

由圖1-B 可知，隨著液料比的增加，樣品中的腐殖酸含量呈先升后降的趨勢。當液料比過小時，樣品發酵產生的腐殖酸溶出不充分。而當液料比大于2．0 mL.g-1后，腐殖酸的溶出達到飽和，其在水相中的溶解量也會增加，使得樣品的實測值有一定降低。因此確定液料比2．0 mL.g-1附近為正交試驗研究區間。

由圖1-C 可知，樣品中腐殖酸的含量隨著銀杏葉渣用量的增加先升高后降低。當銀杏葉渣用量超過25 g 后，體系中的發酵菌種數量和營養不足以支持發酵底物的增加，實測腐殖酸的含量隨之降低。故確定銀杏葉渣用量25 g 附近為正交試驗研究區間。

由圖1-D 可知，葡萄糖用量對樣品中腐殖酸的含量影響較大。隨著葡萄糖用量的增加，樣品中的腐殖酸含量迅速提升，當葡萄糖添加量超過1．5 g 后，腐殖酸的含量開始下降。這可能是由于添加過多的葡萄糖以后，其在水中的溶解度達到了飽和，影響了銀杏葉渣中其他有機成分的溶出，進而減少了腐殖酸的生成。

圖1 發酵時間(A)、液料比(B)、銀杏葉渣用量(C)和葡萄糖用量(D)對腐殖酸含量的影響Fig.1 Effects of fermentation time(A), solid-liquid ratio(B), addition amount of residue of Ginkgo biloba L.(C) and addition amount of glucose(D) on contents of humic acids

2.2 銀杏葉渣制肥的正交試驗

正交試驗和方差分析結果如表2 所示。通過極差分析發現，各因素對腐殖酸含量影響大小的排序為：葡萄糖用量(D)＞銀杏葉渣用量(C)＞發酵時間(A)＞液料比(B)，液料比與方差分析的結果一致；且銀杏葉渣用量(C)和葡萄糖用量(D)對試驗影響顯著(P＜0．05)。進一步比較均值篩選出最優水平為A2B3C2D2，即發酵時間6 d、液料比2．5 mL.g-1、銀杏葉渣用量25 g、葡萄糖用量1．5 g。在該條件下進行驗證試驗，平行3 次，測定腐殖酸平均含量為39．36%。將配方統一換算為百分數表示，即銀杏葉渣添加比例26．95%、去離子水添加比例71．43%、葡萄糖添加比例1．62%。

2.3 銀杏葉渣肥的相關成分的測定

由表3 可知，與《NY 884-2012 生物有機肥》[8]相比，以銀杏葉渣為基質通過微生物發酵所制有機肥樣品的有效活菌數和有機質含量指標明顯優越，且砷、鎘、鉛、鉻和汞均處于安全限量標準內，表明該有機肥樣品具有良好的應用前景。

表2 發酵工藝優化正交試驗直觀分析表Table 2 Visual analysis table of orthogonal experiment for fermentation process optimization

表3 有機肥的相關成分(以干基計)Table 3 Related components of organic fertilizer (dry basis)

2.4 銀杏葉渣制肥對小白菜種子萌發的影響

由圖2 可知，銀杏葉渣有機肥濃度的改變對小白菜種子發芽指數有顯著影響。在一定范圍內隨其濃度的增加，小白菜種子發芽指數逐漸升高，當濃度超過0．4 g.mL-1后，發芽指數開始下降，濃度超過0．8 g.mL-1后下降幅度明顯增加。綜合來看，該銀杏葉渣生物有機肥使用量在0．1 ～0．8 g.mL-1范圍內具有顯著的促生潛力。

2.5 銀杏葉渣制肥對小白菜幼苗生長的影響

根長和苗長(地上部高)是體現植物初期生長狀態的直觀指標，反映當前生境對植物生長的適宜性。由圖3 可知，與CK 相比，隨著銀杏葉渣有機肥濃度(0～0．4 g.mL-1)的提升，小白菜幼苗的根長和苗長顯著提高。當濃度達到0．4 g.mL-1時，根長和苗長分別增加約39．25%和68．50%。繼續提高肥料濃度時，根長和苗長變化不顯著。可見，制得的生物有機肥對小白菜幼苗的根系擴散和植株生長具有明顯的正向促進作用。

根系脫氫酶和硝酸還原酶是對植物生長發揮關鍵調控作用的酶類[14]。由圖4 可知，與CK 相比，銀杏葉渣生物有機肥明顯提高了小白菜幼苗的根系脫氫酶和硝酸還原酶活性。當水浸液中有機肥濃度為0．4 g.mL-1時，小白菜幼苗的根系脫氫酶和硝酸還原酶活性分別較CK 提升約33．48%和27．84%，繼續提高有機肥濃度則對兩種酶的活性影響不大?？梢姡y杏葉渣制肥對植物生長有關的主要酶類具有正向調控作用。

圖2 不同處理水平對小白菜種子發芽指數的影響Fig.2 Effects of different treatment levels on germination index from seeds of Brassica chinensis L.

圖3 不同處理水平對小白菜幼苗根長和苗長的影響Fig.3 Effects of different treatment levels on root and seedling length from seedlings of Brassica chinensis L.

脯氨酸和可溶性糖是植物生長過程中重要的滲透調節物質，其累積量與植物的抗逆性呈相關[15]。黃酮類化合物和有機酸是植物中重要的次生代謝產物，也是對人體健康有益的活性成分，其含量與蔬菜品質密切相關[16-17]。由圖5 可知，銀杏葉渣制肥對小白菜幼苗中脯氨酸、可溶性糖、總黃酮和可滴定酸的積累均有促進作用。當有機肥濃度為0．4 g.mL-1時，小白菜幼苗中脯氨酸、可溶性糖、總黃酮和可滴定酸含量比CK，分別顯著提升約47．95%、213．10%、42．93%和69．75%，繼續增加有機肥濃度則對其含量影響不顯著。

圖4 不同處理水平對根系脫氫酶和硝酸還原酶活性的影響Fig.4 Effects of different treatment levels on activities of root dehydrogenase and nitrate reductase

2.6 銀杏葉渣制肥對小白菜出苗率及幼苗生物量的影響

由表4 可知，施用不同底肥對盆栽小白菜的出苗率和生物量有較大影響。T1(以生物有機肥為底肥)的平均出苗率和生物量顯著高于CK1(空白土壤)和CK2(以氮肥為底肥)，平均出苗率分別提高14．00 和6．66 個百分點，莖葉鮮重和根鮮重依次分別提升85．86%、43．76%(CK1、CK2)和71．43%、20．00%。相比T2(以生物有機-氮復合肥為底肥)，T1的平均出苗率和根鮮重無顯著差異，但莖葉鮮重顯著提高11．13%，總鮮重顯著提高10．77%。表明銀杏葉渣生物有機肥對小白菜的促生作用明顯，且優于傳統氮肥。

3 討論

利用農業廢棄物發酵制備生物有機肥是實現其綜合利用的有效途徑之一。相關研究表明，以豆粕、杜仲葉、菠蘿葉等為原料所制備生物有機肥對蔬菜具有明顯的促生效果[18-21]，而銀杏葉渣中富含氮、磷、鉀等多種微量元素，可將其作為制備優質有機肥的原料[22]?；诖?，本研究以腐殖酸含量為評價指標，采用正交試驗優化EM 菌種發酵銀杏葉渣制備生物有機肥的工藝參數，確定該有機肥最適固態發酵工藝為：銀杏葉渣添加比例26．95%、去離子水添加比例71．43%、葡萄糖添加比例1．62%、發酵時間6 d。肥效驗證結果表明，采用最適固態發酵工藝制備得到的銀杏葉渣生物有機肥可有效提高小白菜種子的發芽指數，促進小白菜幼苗根系和植株的發育，其主要品質指標符合《NY 884-2012 生物有機肥》標準[8]。

圖5 不同處理水平對脯氨酸、可溶性糖、總黃酮和可滴定酸含量的影響Fig.5 Effects of different treatment levels on contents of proline, soluble sugar, total flavonoids and titratable acid

表4 不同底肥對小白菜出苗率及幼苗生物量的影響Table 4 Effect of different base fertilizers on the emergence rate and biomass of Brassica chinensis L.

植物種子萌發過程中，胚乳中所含的蛋白質、淀粉等發生水解生成氨基酸、單糖等小分子化合物，然后再經過合成作用構建植物體[23]。范倩等[24]使用由混合菌劑腐熟紫莖澤蘭所制備的有機肥(EDA)處理小麥種子，使種子發芽率、苗高、發芽指數及活力指數均得到有效提高，并觀察到EDA 對小麥種子胚乳中的蛋白質、淀粉和六磷酸肌醇等大分子物質水解表現出明顯的促進作用。本試驗中，有機肥處理組小白菜幼苗體內的脯氨酸、可溶性糖含量均顯著高于CK，推測該有機肥也是通過加速種子胚乳中大分子物質的水解，增強構建植物體所需基礎物質的供應，從而提高了小白菜種子的發芽指數和幼苗生長速率。

此外，根系中所含的多種呼吸酶對植物的生長也具有關鍵調控作用，酶的活性與植物體內物質轉換、能量代謝等過程密切相關[25-26]。研究發現根系脫氫酶的活性可直接影響植株地上部的營養累積狀況，而硝酸還原酶活性是反映植株對生境中NO-3-N 同化速率的直觀指標[27]，參與了植物氮素代謝通路中催化硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的反應[28]。本試驗中，隨著銀杏葉渣生物有機肥濃度的增加，受試小白菜幼苗的根系脫氫酶、硝酸還原酶活性和總黃酮、可滴定酸含量均呈升高趨勢，與上述研究相互補充、相互驗證。推測是因為微生物在發酵銀杏葉渣的過程中生成的腐植酸等促生因子，促使相關酶的活性發生改變，最終影響植物養分吸收、營養積累等過程。

綜上所述，本研究發現銀杏葉渣生物有機肥的水浸液對小白菜種子萌發及幼苗生長具有顯著的促進作用，小白菜幼苗根系脫氫酶和硝酸還原酶得到激活，幼苗體內總黃酮、可滴定酸含量提高，改善了小白菜的發育水平和品質。本研究為回收利用制藥工業產生的銀杏葉殘渣提供了新思路，但有關該肥料對食用農產品促生作用的田間試驗以及工業化制肥還有待進一步研究。

4 結論

本研究采用正交試驗方法確定了銀杏葉渣制備有機肥的最佳工藝為：銀杏葉渣添加比例26．95%、去離子水添加比例71．43%、葡萄糖添加比例1．62%、EM菌發酵時間為6 d，該條件下肥料的腐殖酸含量為39．27%，有效活菌數、有機質和重金屬含量指標符合《NY 884-2012 生物有機肥》標準。所制銀杏葉渣生物有機肥使用量在0．1 ～0．8 g.mL-1范圍內具有顯著的促生潛力，其水浸液顯著提高了小白菜種子的發芽指數，促進了小白菜幼苗根系和植株的發育；小白菜幼苗根際脫氫酶和硝酸還原酶得到激活，幼苗體內總黃酮、可滴定酸含量提高，改善了小白菜的發育水平和品質。