老白干白酒中糖和糖醇類物質(zhì)研究

王曉丹，向玉萍，印 麗，張福艷，韓 超，姜東明，張煜行*

（1.河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司 河北省白酒釀造工程技術(shù)研究中心，河北 衡水 053000；2.貴州大學 釀酒與食品工程學院 貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

中國白酒是一種在中國有幾千年歷史的酒精發(fā)酵飲料，是世界上最古老的蒸餾酒之一[1]，其有別于其他蒸餾酒的固態(tài)發(fā)酵工藝使得酒體中含有許多復雜的揮發(fā)性和難揮發(fā)性組分，賦予了白酒豐富而又獨具特色的風味特征[2-3]，是廣大科研學者傾盡心血的研究對象。衡水老白干酒以酒色清澈透明，酒體醇香清雅，甘洌挺拔，豐滿柔順，回味悠長的風格特點而被廣大消費者所青睞[4]，是中國白酒老白干香型的典型代表[5]。絕大多數(shù)白酒均呈甜味，甜味是一種讓人感覺比較愉悅的口感，尤其在酒精度高的白酒中，微甜味可以使酒體更加綿柔醇厚[6]。醇類是白酒中醇甜物質(zhì)的來源，是香與味過渡橋梁，含量恰到好處，甜意綿綿，在酒中起調(diào)和作用[7]。

目前，國內(nèi)外檢測糖和糖醇的方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[8]、毛細管電泳（capillary electrophoresis，CE）法[9]、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography mass spectrometry，GC-MS）法[10]以及高效陰離子色譜-脈沖安培（high performance anion chromatography-pulsed amperometric detection，HAPEC-PAD）法[11]等。對于白酒中含量較低的待測組分，HPLC常用的檢測器由于靈敏度低而達不到檢測要求，而氣相色譜（gas chromatography，GC）具有分析速度快、操作簡單、重現(xiàn)性好、分離能力強、靈敏度高[12-13]等優(yōu)點，可用于對酒體中的微量組分進行檢測，但是其分離柱的使用條件一般低于300 ℃，而酒體中糖和糖醇類物質(zhì)的沸點較高，并且直接對白酒進行分析檢測比較困難，所以需選擇有效的預處理方法提取富集以及改變待測組分的狀態(tài)后才能進行準確的鑒定和分析[14]。衍生化法能將一些高沸點、難揮發(fā)的或者熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)轉(zhuǎn)換為沸點低、易揮發(fā)的或穩(wěn)定性良好的待測組分，并且降低有機物的極性，改善色譜峰形，易于氣相色譜分析。衍生化法按照反應類型分為：硅烷化反應、酯化反應、醚化反應和酰化反應。其中硅烷化是使用較為廣泛的方法，再結(jié)合糖和糖醇存在空間位阻效應的特點，使用N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（N,O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetamide with trimethylchlorosilane，BSTFA）作衍生化試劑效果最好[15]。周斌等[16]建立了BSTFA衍生化與GC-MS技術(shù)檢測了煙草中幾種重要游離糖類，且具有較高的準確度。石亞林等[17]使用N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）作為衍生化試劑，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）及氣相色譜-氫火焰離子檢測器（gas chromatography-flame ionization detection，GC-FID）檢測技術(shù)，準確的解析了大曲發(fā)酵過程中糖和糖醇的變化規(guī)律。

目前，關(guān)于使白酒呈現(xiàn)甜味特征的具體成分以及濃度的研究鮮有報道。本研究以老白干香型酒為研究對象，采用衍生化結(jié)合GC-MS檢測方法對衡水老白干酒中的糖和糖醇進行定性、定量分析，并結(jié)合感官品評，分析對酒體甜味特征起重要貢獻的成分，以期為后續(xù)衡水老白干酒體甜味特征的描述以及產(chǎn)品質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)支持和科學的指導。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

感官品評甜味突出的酒樣：甜1-7（取樣時間：2017年11月15）；甜3-10（取樣時間：2017年11月1）；甜18-7（取樣時間：2017年11月15）；甜8-1（取樣時間：2017年11月14）；甜1-3（取樣時間：2017年11月14）；甜2-6（取樣時間：2017年11月13）；甜6小（取樣時間：2017年11月14）；甜8-2（取樣時間：2017年11月14）；上述酒樣均取自衡水老白干酒廠。

葡萄糖、海藻糖、阿拉伯糖、甘油、阿拉伯糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖、蔗糖（均為色譜純）：北京百靈威科技有限公司；赤蘚糖醇（色譜純）：阿拉丁試劑（上海）有限公司；果糖、木糖、甘露糖醇、木糖醇、核糖醇（均為色譜純）：國藥集團化學試劑北京有限公司；C7～C40正構(gòu)烷烴混標：上海安譜實驗科技股份有限公司；吡啶、N,O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）（均為色譜純）：美國Sigma公司；甲醇（色譜純）：北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器與設備

SHZ-DⅢ循環(huán)多用真空泵、PRA-202E旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海普渡生化科技有限公司；TGL-16M臺式高速冷凍離心機：湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；NV-15G氮吹儀：天津博納艾杰爾科技；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市天竟實驗儀器廠；Agilent 7693自動進樣器、Agilent 7890B GC-5977A MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：安捷倫科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品預處理

取酒樣20mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在真空條件下蒸干，用1 mL甲醇溶解，取100 μL于2 mL液相小瓶中，室溫下溫和氮氣吹干，待衍生化。

1.3.2 配制標準溶液

分別用甲醇配制質(zhì)量濃度為100～200 μg/mL的單種標準物質(zhì)，同時配制質(zhì)量濃度為100～500 μg/mL的混合標準溶液，并依次進行梯度稀釋（500μg/mL、400μg/mL、300μg/mL、200 μg/mL、150 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、5 μg/mL），吸取100 μL糖混合標準液、加入100 μL一定濃度的水楊苷，混合均勻后用氮氣吹干，待衍生化。

1.3.3 BSTFA衍生化

氮氣吹干后的樣品，依次加入100 μL BSTFA（含1%三甲基氯硅烷）和50 μL吡啶，搖勻，70 ℃反應3 h，反應完成儲存于-20 ℃，24 h內(nèi)完成檢測。

1.3.4 GC-MS條件

GC條件：色譜柱HP-5 MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度為250 ℃；載氣為氦氣（He），流速1.0 mL/min，分流比為20∶1；升溫程序為40 ℃保持2 min，以6 ℃/min升溫至250℃，并保持15 min。MS條件：電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV，掃描范圍為50～650 amu，離子源溫度230 ℃。

定性方法：已有標準品的物質(zhì)，通過與標準品的質(zhì)譜圖比對進行鑒定；沒有標準品的物質(zhì)，通過與美國國家標準與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）08標準品庫中物質(zhì)的質(zhì)譜圖比對進行臨時性鑒定。

定量方法：內(nèi)標法。以糖和糖醇與內(nèi)標物的峰面積比為橫坐標，質(zhì)量濃度比為縱坐標，建立標準曲線。

1.3.5 感官評價

品評小組包括1名具有近20年白酒品評經(jīng)驗的國家白酒評委，和兩名具有3年以上白酒品評經(jīng)驗的省級白酒評委。感官品評前先經(jīng)培訓練習，參照GB/T 33405—2016《白酒感官品評術(shù)語》[27]中的白酒風味輪所示術(shù)語，品評人員對酒樣（甜18-7、甜6小、甜8-2）的香氣，如花香、甜香、水果香、發(fā)酵香（酒香）、青草香等香氣的感官強度以及酒樣的酸味、甜味、苦味、澀味等口感滋味強度進行評定，評價結(jié)果采用五點標度法進行記錄，數(shù)值范圍為0～5，0表示“無該特征”，1、2表示“弱、微”，3表示“中等”，4、5表示“強、明顯、突出”，取20 mL酒樣于白酒品評專用杯中，在（20±1）℃的溫度條件下進行感官評定，取所得分值結(jié)果的平均值作風味雷達圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒樣中糖和糖醇類物質(zhì)的定性

圖1 糖和糖醇類物質(zhì)標準品經(jīng)三氟乙酰胺衍生化后的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatogram of sugar and sugar alcohols standard derivatized by bistrifluoroacetamide

通過BSTFA衍生化結(jié)合GC-MS分析，檢測到酒樣中含有11種醇甜類物質(zhì)，其中包括4種糖類（阿拉伯糖、木糖、果糖和葡萄糖）、7種多元醇類（甘油、赤蘚糖醇、木糖醇、阿拉伯糖醇、核糖醇、甘露糖醇、山梨糖醇）。上述11種糖和糖醇標品的混合溶液經(jīng)BSTFA衍生化后的總離子色譜圖如圖1所示。其中單糖（阿拉伯糖、木糖、果糖、葡萄糖）會出現(xiàn)兩個峰，這是由于衍生化過程使得單糖的構(gòu)型發(fā)生變化，因此定量時需要將對應的峰面積進行加和。

2.2 酒樣中糖和糖醇類物質(zhì)的定量

根據(jù)上述確定的定量方法，在定性的基礎上對8種酒樣進行定量分析，將不同系列濃度的標準溶液處理好，加入內(nèi)標進行標準曲線的繪制，可得到9種標準品的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、回收率、檢出限及相對標準偏差，結(jié)果見表1。

由表1可知，回收率在92%～100%之間，相關(guān)系數(shù)R2在0.986 0～0.999 4之間，以信噪比為3計算這11種物質(zhì)的檢測限，檢測限在0.143～1.465mg/L，相對標準偏差在3.6%～9.7%，表明該檢測方法具有一定的準確性和精確性。

表1 9種標準品的回歸方程、線性范圍及檢出限Table 1 Regression equation,correlation coefficient and detection limit of 9 standards

由表2可知，在檢測到的糖和糖醇化合物中，葡萄糖的含量最高（3.33 mg/L），其次是甘油（1.20 mg/L），均大于1 mg/L。葡萄糖、甘油均呈甜味。其中甘油含量最大的是酒樣2-6，葡萄糖和果糖含量最高的酒樣是3-10。糖醇類物質(zhì)的含量主要在0.1～1.5 μg/L，其中含量最高的是木糖（0.94 μg/L），其次是阿拉伯醇（0.6 μg/L）和木糖醇（0.28 μg/L），含量最少的為核糖醇（0.1 μg/L）。雖然阿拉伯糖醇、核糖醇和木糖醇互為同分異構(gòu)體，但在白酒中的含量不同，在這批酒樣中含量由高至低依次為阿拉伯糖醇、木糖醇、核糖醇。甘露糖醇和山梨糖醇互為同分異構(gòu)體，在這批酒樣中有的酒樣中沒有是因為含量太低，并未有精確定量的結(jié)果。其中酒樣3-10中含甘露糖醇和山梨糖醇的量最多分別為0.26 μg/L和0.20 μg/L。赤蘚糖醇和阿拉伯糖雖然能在儀器中檢查得到但是含量太低，也并未有精確定量的結(jié)果。

2.3 老白干香型與醬香型白酒的比較

將本實驗結(jié)果與醬香型白酒中糖和糖醇類物質(zhì)進行對比，發(fā)現(xiàn)兩種香型白酒中所含物質(zhì)種類大致相同，但在含量上存在著差異，為探討兩者存在差異的可能原因，將從功能酵母菌種類及生產(chǎn)工藝進行分析，區(qū)別詳見表3。

表3 老白干香型與醬香型白酒的比較Table 3 Comparison of Laobaigan-flavor and sauce-flavor Baijiu

由表3可知，從兩種香型白酒生產(chǎn)過程中分離純化出的產(chǎn)糖或糖醇的功能酵母，在種類和來源上都存在著很大的不同。衡水老白干采用的是中溫大曲，比醬香型白酒的高溫大曲的發(fā)酵溫度低10 ℃左右，醬香型白酒的大曲中溫度高且含糖量高，從而能在大曲中分離出更多種類的產(chǎn)多元醇的酵母。白酒釀造屬于固態(tài)厭氧發(fā)酵，酒醅充當著微生物生長培養(yǎng)基的角色。衡水老白干酒有續(xù)茬混蒸混燒老五甑工藝與清蒸清燒三排凈工藝，其中地缸發(fā)酵則是衡水老白干酒必不可少的典型工藝[20-22]。地缸發(fā)酵便于熱量散發(fā)，保持最佳發(fā)酵溫度，地缸周圍土壤與地缸外表面的接觸面是一個熱量交換面，酒醅與地缸之間熱量通過地缸壁進行傳遞，達到一種熱平衡[23]，從而促進酒精的生成；并且密封性好，有利于酵母在無氧條件下的發(fā)酵作用[24]。而醬香型白酒釀造處于高溫、多雨、潮濕的氣候環(huán)境中，從而形成了醬酒“三高”工藝特點[20]，其中“高溫堆積”又稱“二次制曲”，是醬香型白酒生產(chǎn)過程中的核心工藝之一，在相對開放式的空間環(huán)境條件下，為酒醅富集培養(yǎng)了大量的微生物，使后期入窖發(fā)酵順利進行，酵母菌主要就是通過高溫堆積階段進入整個發(fā)酵環(huán)節(jié)的[22]；并且，該過程也為醬香型白酒選擇出適合生產(chǎn)的優(yōu)勢微生物[25]。綜上，由于兩種香型的白酒在核心工藝和生產(chǎn)環(huán)境的不同，引起發(fā)酵過程中功能微生物種類的區(qū)別，最終使得帶入酒體中的糖和糖醇類物質(zhì)存在著差異。

2.4 甜味突出酒樣滋味分析

在白酒中，呈香呈味的微量成分僅占1%～2%，實驗中所檢出的糖和糖醇類物質(zhì)本身均呈甜味，它們在酒體呈甜滋味中能起到一定作用，是白酒中甜味的主要來源，另外有文獻指出，白酒中除了多元醇呈現(xiàn)甜味以外，也有檢測到其他有些成分呈現(xiàn)甜味，如乳酸乙酯、棕櫚酸乙酯等在一定濃度時都帶有微甜味[26]，然而白酒中的甜味是本身物質(zhì)的存在，同時也是各味協(xié)調(diào)的結(jié)果。白酒中的各種成分相互配合，協(xié)調(diào)比例后會使酒體產(chǎn)生“甜”的滋味特征，使得酒體的氣、味達到和諧，給人帶來愉悅舒適的口感體驗。

后期挑選了3個實驗所用的甜味突出酒樣，參照GB/T 33405—2016《白酒感官品評術(shù)語》中白酒風味輪的感官術(shù)語[27]，對各個風味特征進行感官品評，結(jié)果采用五點標度法，整理結(jié)果做出3個酒樣的風味雷達圖見圖2。

圖2 甜味突出酒樣風味輪廓分析Fig.2 Flavor profile analysis of particularly sweet Baijiu samples

整體上來說，這3個酒樣的風味輪廓圖略有差異，但各風味特征強度走向大致相同，甜味和甜香都非常突出，澀味、苦味等影響酒體口感的不良味道強度較弱，并兼具較強烈的果香、花香以及特有的棗香味，糖和糖醇類物質(zhì)的含量在整個酒體中只占0.03%左右，但在感官品評上卻呈現(xiàn)了非常突出的甜味以及甜香的特征。

3 結(jié)論

在本次研究中，使用BSTFA衍生化結(jié)合GC-MS技術(shù)對酒樣中的糖和糖醇類化合物進行檢測，共測到11種物質(zhì)，包括4種糖和7種糖醇類物質(zhì)。并精確定量了其中的3種糖和6種糖醇類物質(zhì)，其中，糖類的葡萄糖（3.33 mg/L）和糖醇類的甘油（1.20 mg/L）含量較高。總的糖和糖醇類物質(zhì)在白酒微量成分中所占比例低至0.03%左右，雖然含量非常少，但這些物質(zhì)本身呈現(xiàn)甜味，對酒體的呈甜滋味有一定貢獻，給人以“綿甜”、“柔和”的味覺感受，糖和糖醇類物質(zhì)與其他微量成分之間相互協(xié)調(diào)、配合，構(gòu)成了衡水老白干酒“醇香清雅，酒體協(xié)調(diào)、醇厚甘冽、回味悠長”的風格特點。現(xiàn)已對衡水老白干酒體中呈甜成分進行了準確的定量分析，為酒體設計以及質(zhì)量控制提供了理論依據(jù)。今后可致力于生產(chǎn)工藝或菌種選育等方面的研究，來提高白酒中糖或糖醇的含量，在保證酒體中醇、酸、酯等成分的整體協(xié)調(diào)的基礎上，以期達到增加酒體醇厚感，提高白酒品質(zhì)的目的。