一株高效降解乳酸的原玻璃蠅節(jié)桿菌篩選與代謝動(dòng)力學(xué)分析

羅青春，喬宗偉，2，鄭 佳，2 *，張 霞，雷學(xué)俊，施 思，劉多濤

（1.宜賓五糧液股份有限公司，四川 宜賓 644007；2.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644007）

濃香型白酒是我國(guó)傳統(tǒng)白酒中的典型代表之一，其品質(zhì)及風(fēng)格由各種風(fēng)味物質(zhì)的量比關(guān)系決定[1]，優(yōu)質(zhì)濃香型白酒中，四大酯類(lèi)的比例為己酸乙酯＞乳酸乙酯＞乙酸乙酯＞丁酸乙酯[2-3]。乳酸乙酯含量過(guò)高，使得酒體發(fā)澀、主體香差，嚴(yán)重影響酒的品質(zhì)。糟醅發(fā)酵過(guò)程中乳酸含量過(guò)高，易與窖池內(nèi)鈣、鐵離子反應(yīng)，形成乳酸鈣、乳酸鐵和乳酸亞鐵，從而導(dǎo)致窖泥板結(jié)老化，嚴(yán)重影響窖泥微生物的正常代謝[4-6]。因此“降乳”是濃香型白酒生產(chǎn)企業(yè)迫切解決的問(wèn)題之一。

目前研究中，“降乳”的主要方法有：添加抑制劑或輔酶，如富馬酸可抑制乳酸菌的生長(zhǎng)[7]；控制優(yōu)化生產(chǎn)工藝，如適當(dāng)控制入窖淀粉的含量、降低入窖溫度、控制用曲量等；添加乳酸降解菌，其中添加乳酸降解菌操作簡(jiǎn)單，還可以生成乙酸、丙酸、丁酸等香氣前體物質(zhì)[8]，從而合成多種酯類(lèi)物質(zhì)來(lái)增加白酒中的香氣成分。因而從釀酒體系中篩選出具有乳酸降解能力的野生微生物菌株對(duì)優(yōu)化白酒指標(biāo)、改善窖泥理化狀態(tài)不失為一種較為合理的途徑。自然界里能夠利用乳酸作為碳源的微生物很多，在已有報(bào)道中，分離到的乳酸降解菌主要有丙酸桿菌屬、醋桿菌屬、固氮菌屬、芽孢桿菌屬、脫硫弧菌屬等多個(gè)屬的一些種的某些菌株[9-10]。窖泥是傳統(tǒng)固態(tài)法白酒發(fā)酵的基礎(chǔ)，窖泥中含有數(shù)量龐大、種類(lèi)復(fù)雜的微生物菌群，部分微生物在發(fā)酵過(guò)程中進(jìn)入白酒糟醅中繁殖和代謝，產(chǎn)生復(fù)雜多樣的代謝產(chǎn)物，形成種類(lèi)豐富的風(fēng)味物質(zhì)，形成白酒風(fēng)格和品質(zhì)[11-13]。近年來(lái)，窖泥微生物菌群的研究表明，窖泥的優(yōu)勢(shì)微生物菌群包括：八疊球菌屬（Sporobacter）、紅蝽?xiàng)U菌屬（Coriobacterium）、梭菌屬（Clostridium）、纖維素單胞菌屬（Cellulomonas）、Sediminibacter、氨基桿菌屬（Aminobacter）、棒桿菌屬（Corynebacterium）、Sporosarcina、醋桿菌屬（Acetobacter）、互營(yíng)菌屬（Syntrophus）等[14-15]。同時(shí)，已有研究團(tuán)隊(duì)從窖泥中篩選出具有乳酸降解能力的菌株，如Clostridium、Terrisporobacter、芽孢桿菌屬（Bacillus）、泥桿菌屬（Ilyobacter）、脫硫腸狀菌屬（Desulfotomaculum）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）和拉烏爾菌屬（Raoultella）等[10]。

本研究試圖從窖泥中篩選出一株乳酸降解菌，以期對(duì)濃香型白酒“降乳”提供了一種新的菌株，豐富對(duì)窖池稀缺微生物資源的認(rèn)識(shí)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來(lái)源

樣品取自宜賓五糧液股份有限公司窖齡為20年窖池的窖底泥，窖池分別在窖底4個(gè)角落和接近中心點(diǎn)的一點(diǎn)各取一個(gè)樣，每個(gè)樣品質(zhì)量約100 g，在無(wú)菌袋中混勻后立即使用。

1.1.2 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：NaCl 1 g、K2HPO41 g、NH4Cl 1 g、MgCl20.5 g、NaNO31 g、葡萄糖2 g，溶于500 mL蒸餾水中，酒糟20 g、黃水10 mL、曲粉6 g、酒尾20 mL，溶于500 mL蒸餾水中攪動(dòng)0.5 h后用8層紗布過(guò)濾，再混合后用NaOH調(diào)節(jié)pH至6.5～7.0。

無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO40.5 g、KH2PO41 g、NH4Cl 1 g、6.67 g/L CaCl23 mL、17 g/L FeCl33 mL、FeSO4·7H2O 0.05 g、NaNO31 g、不同濃度乳酸（唯一碳源）、1 000 mL蒸餾水。

保藏培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基[16]。

1.2 儀器與設(shè)備

5810高速冷凍離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司；BX41生物顯微鏡：日本Olympus公司；inoLabpH740 pH計(jì)：德國(guó)WTW公司；LRH生化培養(yǎng)箱、THZ-98C恒溫振蕩器：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Ezup柱式細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）抽提試劑盒（SK8255）：上海生工生物有限公司；API Coryne棒狀桿菌鑒定試劑盒：法國(guó)生物梅里埃公司；乳酸（色譜純）：比利時(shí)Acros Organics公司；乙醇（色譜純）：美國(guó)HoneyWell公司；4-辛醇（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；頂空固相微萃取裝置（CAR/DVB/PDMS纖維萃取，50 μm，1 cm長(zhǎng)）：美國(guó)Supelco公司；PAL RTC2多功能樣品前處理平臺(tái)（帶有SPME模塊）：瑞士CTC公司；7890B GC-5977B MSD氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、1100系列高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國(guó)Agilent公司；高效液相色譜色譜柱Venusil ASB C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）：美國(guó)Agela公司。

1.3 方法

1.3.1 乳酸降解菌的篩選

（1）富集培養(yǎng)

將窖泥樣品以4%的接種量接種于含4 g/L乳酸的富集培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)15 d。

（2）初篩

將富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?.1 mL 10-6稀釋液涂布于無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)3 d，挑取單菌落在新的無(wú)機(jī)鹽平板上劃線純化。

（3）復(fù)篩

方法同上，將上述篩選的菌株接種于無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，培養(yǎng)15 d后，取發(fā)酵液進(jìn)行乳酸含量測(cè)定。

（4）乳酸測(cè)定

取上述發(fā)酵液0.1mL，以0.1%的磷酸水溶液稀釋至1mL，于2 mL離心管中，振蕩均勻，0.2 μm濾膜過(guò)濾后作為待測(cè)樣品。

利用HPLC法測(cè)定發(fā)酵液中乳酸的含量。色譜條件為柱溫30 ℃；流動(dòng)相A為甲醇，B為0.1%磷酸水溶液。梯度洗脫程序?yàn)? min：100%B；8 min：100%B；25 min：10%B；28.5 min：10%B；29 min：100%B；35 min：100%B；停止：35 min；流速：1.0 mL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)：214.8 nm。

1.3.2 乳酸降解菌的鑒定

（1）形態(tài)觀察實(shí)驗(yàn)

形態(tài)觀察包括菌落形態(tài)、革蘭氏染色觀察[17]。

（2）生理生化特性

生理生化利用API Coryne棒狀桿菌鑒定試劑盒進(jìn)行鑒定。

（3）分子生物學(xué)鑒定

DNA提取：將篩選的降解效果最好的菌株接入保藏培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)15 d，取1 mL菌液10 000 r/min離心5 min，棄上清液，收集菌體，按細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（B518225）提取DNA，-20 ℃保藏備用。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增：利用引物27F和1492R對(duì)細(xì)菌基因組16S rRNA進(jìn)行擴(kuò)增，27F：5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'。擴(kuò)增體系（25 μL）：10×PCR buffer 2.5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）（2.5mmol/L）1μL，DNA10ng，引物F（10 μmol/L）0.5 μL，引物R（10 μmol/L）0.5 μL，加雙蒸H2O至25 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃、4 min；94 ℃、45 s，55 ℃、45 s，72 ℃、60 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，4 ℃終止反應(yīng)。

16S rRNA序列測(cè)定：利用膠回收試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的純化；純化產(chǎn)物的測(cè)序工作由上海生工生物工程有限公司完成。

系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建：將所測(cè)定的細(xì)菌16S rRNA基因序列分別與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLASTn和RDP Classifier相似性分析，選取與實(shí)驗(yàn)菌株親緣關(guān)系相對(duì)較近的標(biāo)準(zhǔn)菌株用Clustalw軟件進(jìn)行序列比對(duì)，采用MEGA5軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用鄰接（neighbor-joining，NJ）法，Bootstrap驗(yàn)證次數(shù)為1 000。

序列提交到NCBI Genbank，獲得登錄號(hào)為MH256112。

1.3.3 乳酸降解菌的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)

將菌株WLY-B-L2種子液按5.0%（V/V）的接種量分別接種到LB培養(yǎng)液中（pH7.0），30 ℃、120 r/min培養(yǎng)，于不同時(shí)間取菌液測(cè)吸光度值（OD600nm值）。每個(gè)樣品均重復(fù)3次，取平均值。

采用Logistic方程描述菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型。在此方程中比生長(zhǎng)速率與尚未利用的負(fù)載能力相關(guān)聯(lián)，即生長(zhǎng)期細(xì)胞的增長(zhǎng)速率可以用下式表達(dá)[18]。

當(dāng)t=t0時(shí)，X=X0時(shí)，將上式積分得到下式。

式中：X為菌體濃度（OD600nm值）；t為培養(yǎng)時(shí)間，h；um為最大比生長(zhǎng)速率，h-1；X0為初始菌體濃度（OD600nm值）；Xm為最大菌體濃度（OD600nm值）。

1.3.4 乳酸降解菌的降解動(dòng)力學(xué)

將菌株WLY-B-L2種子液按5.0%（V/V）的接種量分別接種到含2g/L、4g/L、6g/L、8g/L乳酸的LB培養(yǎng)液中（pH 7.0），30 ℃、120 r/min培養(yǎng)，于不同時(shí)間取菌液，測(cè)乳酸殘留量，對(duì)照試驗(yàn)接入同體積無(wú)菌水作空白對(duì)照。每個(gè)樣品均重復(fù)3次，取平均值。

對(duì)于乳酸降解動(dòng)力學(xué)模型，采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型[19]：

式中：b為常數(shù)；c為底物濃度，g/L；k為一級(jí)降解速率常數(shù)；t為降解時(shí)間，h。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸降解菌株的分離篩選

乳酸質(zhì)量濃度分別為1 g/L、2 g/L和4 g/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板均能生長(zhǎng)出菌落。從乳酸質(zhì)量濃度為4 g/L無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基平板上挑取10株菌，在30 ℃靜置培養(yǎng)15 d，菌液經(jīng)液相色譜測(cè)定后，篩選出了降解效果最好的菌株WLY-B-L2，其乳酸降解率為16.9%（空白組乳酸含量為4.08 g/L，試驗(yàn)組乳酸含量為3.39 g/L）。

2.2 菌株WLY-B-L2的鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察結(jié)果

圖1 菌株WLY-B-L2的顯微（a）及菌落（b）形態(tài)Fig.1 Microscope (a) and colony (b) morphology of strain WLY-B-L2

由圖1a可知，菌株WLY-B-L2的細(xì)胞革蘭氏染色呈陽(yáng)性，桿狀；由圖1b可知，菌落呈白色、表面光滑濕潤(rùn)、中間凸起、邊緣整齊。

2.2.2 生理生化特性

由表1可知，WLY-B-L2能利用硝酸鉀、吡嗪酰胺、2-萘基磷酸、2-奈基-α-D-吡喃糖苷、明膠（牛源）。不能利用吡咯烷酮-2-奈胺、萘酚-ASB1-β-D-葡萄糖醛酸鹽、2-奈基-β-D-半乳糖苷、1-奈基-N-乙酰基-β-D-氨基葡萄糖苷、七葉靈檸檬酸鐵、尿素、葡萄糖、核糖、木糖、甘露醇、麥芽糖、乳糖（牛源）、蔗糖、糖原。過(guò)氧化氫試驗(yàn)結(jié)果呈陽(yáng)性。

表1 菌株WLY-B-L2的生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 Results of physiological and biochemical experiments of strain WLY-B-L2

2.2.3 分子生物學(xué)鑒定

圖2 基于16S rDNA基因序列菌株WLY-B-L2的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain WLY-B-L2 based 16S rDNA gene sequences

將菌株16SrRNA基因序列與GenBank上的其他16SrRNA基因序列進(jìn)行基本局部比對(duì)搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，菌株WLY-B-L2與Arthrobacter protophormiaestrain DSM 20168（NR_026195）相似性為99.9%，結(jié)合生理生化特性、形態(tài)特征將該菌鑒定為放線菌目下的原玻璃蠅節(jié)桿菌（Arthrobacter protophormiae）。經(jīng)RDP進(jìn)行分類(lèi)，其分類(lèi)地位為：放線菌綱（Actinobacteria）放線菌目（Actinomycetales）微球菌科（Micrococcaceae）節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）。

2.3 降解菌WLY-B-L2的生長(zhǎng)曲線

在LB培養(yǎng)基中接種WLY-B-L2，測(cè)定其菌體在不同培養(yǎng)時(shí)間的OD600nm值，利用SPSS 22.0軟件對(duì)菌株生物量實(shí)測(cè)值與菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行非線性擬合，如圖3所示，得到um=0.219 h-1，X0=0.622，Xm=2.318，代入方程（1）和（2）后得到菌株生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程：

X=0.622e0.219t/[1-0.268（1-e0.219t）]

其中，R2=0.971。

圖3 菌株WLY-B-L2的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of strain WLY-B-L2

2.4 降解菌WLY-B-L乳酸降解生長(zhǎng)曲線

圖4 不同培養(yǎng)時(shí)間的乳酸殘留量Fig.4 Residual concentration of lactic acid in different cultivation time

由圖4可知，菌株WLY-B-L2具有較強(qiáng)的降解乳酸的功能，不同質(zhì)量濃度下經(jīng)過(guò)80 h后乳酸均未檢測(cè)到。

進(jìn)一步采用一級(jí)動(dòng)力學(xué)模型對(duì)圖4數(shù)據(jù)進(jìn)行降解方程構(gòu)建，結(jié)果如表2所示，三種不同質(zhì)量濃度下的降解方程分別為c=3.00-0.037 50t、c=6.01-0.083 75t、c=9.03-0.066 25t。

表2 不同質(zhì)量濃度乳酸下菌株WLY-B-L2的乳酸降解方程Table 2 Lactic acid degrading equations of strain WLY-B-L2 under different concentrations of lactic acid

3 討論

過(guò)去研究表明大多數(shù)放線菌能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，如抗生素、有機(jī)酸、氨基酸、微生物甾體酶及酶抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑等[20-22]；有些放線菌還能降解大量的各種有機(jī)物，從而參與自然界物質(zhì)循環(huán)、凈化環(huán)境、改良土壤[23-24]。然而，目前關(guān)于濃香型白酒窖泥放線菌的報(bào)道還較少，至今還未見(jiàn)有關(guān)濃香型白酒節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）的相關(guān)報(bào)道。劉茂柯等[25]利用PCR-變性梯度凝膠電泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）研究了窖泥放線菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性，表明窖泥放線菌歸于Olsenella，Atopobium，Streptomyces和Corynebacterium四個(gè)屬，Olsenella，Atopobium優(yōu)勢(shì)度隨窖齡延長(zhǎng)而升高。裴樂(lè)樂(lè)等[26]利用熒光定量PCR研究了不同窖齡窖泥放線菌，發(fā)現(xiàn)隨著窖齡的增加，放線菌數(shù)量隨之增加。此外，王濤等[27]從窖泥中分離到的Streptomyces屬的多株放線菌可產(chǎn)酯、酸、醛、酮和醇類(lèi)等濃香型白酒中的重要呈香呈味物質(zhì)。

本研究中首次從窖泥中篩選出能降解乳酸的放線菌，在乳酸最大初始質(zhì)量濃度為9 g/L的培養(yǎng)基體系中發(fā)酵80 h后乳酸降解率達(dá)100%，降解效果較為理想。鄧漢森等[28]從濃香型白酒糟醅中篩選出一株可以降解乳酸的酵母菌。隨后，栗連會(huì)[10]也從酒醅中篩選分離到歸屬于Clostridium，Terrisporobacter，Bacillus，Ilyobacter，Desulfotomaculum，Staphylococcus和Raoultella等7個(gè)屬的17種乳酸降解菌，I.delafieldii的降解效果最佳，降解率為100%，同時(shí)C.cochlearium，C.tyrobutyricum和C.roseum的降乳效率也超過(guò)50%，分別達(dá)到了94.1%，67.6%，55.9%。而S.epidermidis，R.ornithinolytica，B.amyloliquefaciens和B.amyloliquefaciens的降乳效率均低于25%，降乳效果較差。

4 結(jié)論

本研究從濃香型窖泥中篩選出了一株乳酸降解菌，經(jīng)多重鑒定，菌株WLY-B-L2為原玻璃蠅節(jié)桿菌（Arthrobacter protophormiae），系國(guó)內(nèi)首次分離到了降解乳酸的放線菌。其生長(zhǎng)、降解過(guò)程分別符合Logistic生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)（um=0.219 h-1，Xm=2.318）和一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型，當(dāng)乳酸初始質(zhì)量濃度為3 g/L、6 g/L和9 g/L時(shí)，WLY-B-L2完全降解乳酸的時(shí)間分別為40 h、72 h和80 h。放線菌是窖泥中棲息的功能微生物菌群之一，并且對(duì)乳酸具有顯著的降解作用，豐富了對(duì)放線菌在窖泥中功能的認(rèn)識(shí)。