北五味子汁蘋果酸-乳酸發酵工藝優化及其抗氧化性研究

張 晟，張雅娜，馬麗媛，王 鵬*

（綏化學院 食品與制藥工程學院，綏化 152061）

北五味子性溫，可收斂固澀、益氣生津與補腎寧心[1]，果實中有大量的多糖、木脂素、花色苷、多酚等功能性成分[2-3]，其具有治療代謝綜合征、輔助睡眠等作用[4-7]。由于北五味子特殊的藥用價值，已成為國內外研究的熱點，關于五味子低醇飲料[8]、五味子米酒[9]、五味子麥芽酵素[10]、五味子發酵果醬[11]以及五味子發酵物的抗炎作用[12]等更是進行了深入的研究。但是，由于北五味子過高的酸度[13-15]，使得其相關產品的開發受到了很大程度的限制。目前，化學降酸法被廣泛的應用于北五味子果汁的降酸，雖然其降酸的效果顯著，但嚴重制約了其口感、色澤與氣味等，還未見報道關于北五味子汁的生物降酸法。

蘋果酸-乳酸發酵（malolactic fermentation，MLF）主要是在乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）作用下，通過蘋果酸-乳酸酶將更為酸澀的L-蘋果酸脫羧基降解為更加柔和的L-乳酸，同時伴隨二氧化碳的產生[16]，從而降低發酵飲品的酸度。

本研究將酒酒球菌（Oenococcus oeni）應用在北五味子汁的蘋果酸-乳酸發酵過程中，研究了接種量、發酵溫度、發酵時間及初始pH對其降酸的影響，并對比降酸前后的抗氧化指標，旨在最大限度保留北五味子功能成分，同時更加安全與有效地降低其果汁酸度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北五味子鮮果：吉林長白山制藥有限責任公司；酒酒球菌（Oenococcus oeni）6066：中國工業微生物菌種保藏管理中心；NaHCO3（食品級）：市售；活化培養基、無水醋酸鈉、2,4,6-三吡啶基三嗪、濃鹽酸、氯化鐵、硫酸亞鐵：哈爾濱盛世天澤生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、2,2-聯氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazo line-6-sulphonate，ABTS）、2-D-脫氧核糖：美國Sigma公司；L-蘋果酸測定試劑盒：北京百奧康生物技術有限公司。本研究所用試劑均為食品級或分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-3C數顯臺式pH計：安徽賽科環?？萍加邢薰荆籗W-CJ-1D超凈工作臺：上海舍巖儀器有限公司；LRH-70F生化培養箱：無錫瑪瑞特科技有限公司；723N可見分光光度計：杭州俊升科學器材有限公司。

1.3 方法

1.3.1 北五味子汁蘋果酸-乳酸發酵工藝流程及操作要點

北五味子→榨汁→調節pH→滅菌→冷卻→接種酒酒球菌→發酵→發酵液

操作要點：

北五味子果汁制備：選取新鮮北五味子，除去霉爛部位與次果，去籽，以1∶1比例加入飲用水，使用榨汁機打漿。

初始pH調節：使用1.0mol/LNaHCO3溶液調節pH達到3.4。滅菌：將其置于水浴環境為65 ℃條件下處理30 min。接種：將購買的酒酒球菌6066接種到制備的斜面培養基上，37 ℃培養12 h，連續傳代3次，隨后接入液體培養基中，按平板菌落計數法測得其活菌數約為2×108CFU/mL。按照果汁7%的體積接種。

發酵：將樣品置于24 ℃條件下發酵8 d，得到成品。

1.3.2 北五味子汁蘋果酸-乳酸發酵工藝參數優化單因素試驗

（1）接種量對北五味子汁MLF的影響

將北五味子汁pH調整為3.4，分別接種3%、5%、7%、9%、11%的酒酒球菌，24 ℃條件下發酵8 d，發酵結束后檢測蘋果酸含量，探究不同接種量對發酵結果的影響。

（2）發酵溫度對北五味子汁MLF發酵結果的影響

將北五味子汁pH調整為3.4，接種量為7%，調整發酵溫度分別為20 ℃、22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃，發酵8 d，發酵結束后檢測蘋果酸含量，探究不同發酵溫度對發酵結果的影響。

（3）發酵時間對北五味子汁MLF發酵結果的影響

將北五味子汁pH調整為3.4，接種量為7%，調整發酵溫度為24 ℃，選取發酵時間為6 d、7 d、8 d、9 d、10 d進行MLF發酵，發酵結束后檢測蘋果酸含量，探究不同發酵時間對發酵結果的影響。

（4）初始pH對北五味子汁MLF發酵結果的影響

將北五味子汁pH調整為3.4，接種量為7%，發酵溫度為24℃時，分別調整初始pH為2.8、3.1、3.4、3.7、4.0發酵8d，發酵結束后檢測蘋果酸含量，探究不同初始pH對發酵結果的影響。

1.3.3 北五味子汁蘋果酸-乳酸發酵工藝參數優化正交試驗

按照Box-Behnken的試驗設計原理，以蘋果酸降解率（R）為響應值，選擇五味子汁MLF的接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、初始pH（D）為影響因素，進行3因素3水平Box-Behnken試驗，因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments

1.3.4 指標檢測

（1）L-蘋果酸的檢測

總蘋果酸的檢測通過L-蘋果酸測定試劑盒測定，蘋果酸降解率計算公式如下：

蘋果酸降解率=（1-C/C0）×100%

式中：C為發酵后蘋果酸含量（以蘋果酸計），mg/L；C0為空白組，即未經發酵的五味子汁中L-蘋果酸含量，mg/L。

（2）DPPH自由基清除率的測定

取0.2 mL溶液，添加2.8 mL的0.2 mmol/L DPPH溶液，混勻，室溫放置30 min，波長517 nm處測定吸光度值。甲醇作為調零管，樣品加DPPH為樣品組AS，甲醇替代提取液作為空白組A0[17]。DPPH自由基清除率計算公式如下：

（3）還原力的測定

取相同體積待測樣品、1%的鐵氰化鉀溶液與0.02 mol/L的磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 6.6），將其充分混勻，50 ℃處理20 min。待其冷卻后，添加10%的三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液0.5mL，離心（3000r/min，8 min），取上清液、蒸餾水0.1%的三氯化鐵溶液，以1∶1∶1體積充分混勻，靜置5min，在波長700nm處測定吸光度值。以L-半胱氨酸鹽酸鹽（50～300 μmol/L）標準曲線計算，以μmol/L表示[18]。

（4）鐵離子還原能力的測定

取0.3 mmol/L的醋酸鈉緩沖液（pH 3.6）、0.01 mmol/L的2,4,6-三（2-吡啶基）三嗪（2,4,6-tripyridin-2-yl-1,3,5-triazine，TPTZ）-HCl溶液、0.02 mmol/L的FeCl3溶液以10∶1∶1混合配成工作液。添加0.1 mL待測樣品，3 mL鐵離子還原法（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）工作液（提前37 ℃水浴處理），添加0.3 mL去離子水，立即混勻，37 ℃水浴7 min，在波長593 nm處測定其吸光度值，以FeSO4（0.025～0.400 mmol/L）作為標準曲線，以mmol/L FeSO4表示[18]。

（5）ABTS自由基清除率的測定

取7 mmol/L的ABTS溶液10 mL與7.35 mmol/L的過硫酸鉀溶液5 mL避光放置16 h，作為ABTS+·溶液。利用無水乙醇稀釋適當濃度，波長734 nm處測定其吸光度值Ac，要求在0.70±0.02左右。將15 μL樣品與2.8 mL的ABTS+·溶液混勻，放置6 min后，波長734 nm處測定吸光度值As[17]。

1.3.5 數據分析

通過Origin8.6繪制圖，SPSS V17.0軟件進行顯著性分析（P＜0.05），每組試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 接種量對北五味子汁發酵的影響

由圖1可知，隨著酒酒球菌接種量的增大，蘋果酸降解率呈現出先增大后減小的趨勢，在接種量為7%時達到最大，接種量繼續增大則蘋果酸降解率有輕微下降趨勢。可能是由于北五味子汁中的營養素含量有限，接種量過大在MLF前期可使得菌種迅速增加，但后期會由于體系中的養分無法充分提供，進而使得菌株大量死亡，造成降解率有所下降。因此最佳接種量為7%。

圖1 接種量對蘋果酸降解率的影響Fig.1 Effect of inoculum on malic acid degradation rate

2.2 發酵溫度對北五味子汁發酵的影響

圖2 發酵溫度對蘋果酸降解率的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on malic acid degradation rate

由圖2可知，隨著發酵溫度升高，蘋果酸降解率增大，發酵溫度達到24 ℃時，降解率最大，繼續升高發酵溫度蘋果酸降解率呈減小趨勢。可能是因為酒酒球菌的生長對溫度較為敏感，環境溫度較低時，菌株無法充分的生長，使得產酶量與酶活力都較低，導致降酸效果不理想。隨著溫度升高，酶活力也同樣升高，但環境因為溫度過高和過低都不是乳酸菌的適宜生長和代謝溫度進而導致其MLF發酵效果變差。因此最佳發酵溫度為24 ℃。

2.3 發酵時間對北五味子汁發酵的影響

由圖3可知，隨著發酵時間的延長，蘋果酸降解率呈先增大后減小的趨勢，當發酵時間為8 d時，蘋果酸降解率最高，當發酵時間超過8 d時，降解率有所下降，過長時間的MLF會使得其他微生物污染反而會增加風險，因此，選擇發酵時間為8 d。

圖3 發酵時間對蘋果酸降解率的影響Fig.3 Effect of fermentation time on malic acid degradation rate

2.4 初始pH對北五味子汁發酵的影響

圖4 初始pH對蘋果酸降解率的影響Fig.4 Effect of initial pH on malic acid degradation rate

由圖4可知，隨著初始pH的增大蘋果酸降解率呈現出先增大后減小的趨勢，且初始pH為3.4時降解率達最大，過低的初始pH會抑制酒酒球菌的生長，使得蘋果酸降解率下降，而過高的初始pH可能會影響酒酒球菌產酶的能力[19-20]，使得蘋果酸的降解率有所下降。因此最佳初始pH為3.4。

2.5 北五味子汁蘋果酸-乳酸工藝參數優化正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選取酒酒球菌接種量（A）、發酵溫度（B）、發酵時間（C）、初始pH（D）為影響因素，以蘋果酸降解率（R）為響應值，采用4因素3水平的響應曲面試驗考察各發酵條件對發酵效果的影響，試驗設計與結果見表2。

通過統計分析軟件Design-Expert 8.0.6對表2數據進行分析，建立回歸模型如下：

R=58.72-3.19A-1.34B-1.14C+2.33D+0.050AB+3.05AC+4.82AD-1.10BC+3.43BD+2.12CD-20.80A2-14.25B2-7.33C2-7.10D2

由表3可知，響應面優化擬合出的方程回歸項極顯著（P＜0.000 1），且失擬項0.164 6＞0.05，說明響應值預測良好。擬合模型方程的決定系數R2=97.28%，表明所建立的模型可以用來解釋97.28%的響應變化，調整決定系數R2Adj=94.55%，說明該模型能解釋94.55%響應值的變化，擬合程度較好，以上指標均能證明該擬合方程有較好的擬合效果。由F值大小得出影響因素影響程度由高至低依次為A＞D＞B＞C，即接種量＞初始pH＞發酵溫度＞發酵時間。兩兩因子的相互作用對于響應值影響的響應面分析如圖5所示。

表2 發酵條件優化響應面試驗設計及結果Table 2 Design and results of response surface experiments for fermentation condition optimization

續表

表3 響應面試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of response surface experiment results

圖5 各因素交互作用對蘋果酸降解率影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interactions between each factors on malic acid degradation rate

應用響應面尋優分析方法對回歸模型進行描述，接種量、發酵溫度、發酵時間、初始pH和對應的編碼值分別為-0.068、-0.030、-0.073和0.122。尋找最優發酵工藝參數為：酒酒球菌接種量6.93%、發酵溫度23.97 ℃、發酵時間7.46 d、初始pH 3.44，在此條件下，蘋果酸降解率預測值為59.03%。但考慮實際的操作情況，將發酵工藝參數調整為酒酒球菌接種量7%、發酵溫度24 ℃、發酵時間8 d、初始pH 3.4。

根據擬合條件進行驗證性試驗，3組平行試驗的蘋果酸降解率實際值為59.00%，與理論預測值僅相差0.03%。因此，采用響應面分析法優化得到的北五味子汁MLF工藝條件參數準確可靠，實用價值較高。

2.6 北五味子汁MLF前后抗氧化活性對比

通過以上最優工藝進行北五味子汁MLF，檢測發酵前后DPPH自由基清除率、還原力、鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，FRAP）、ABTS自由基清除率等指標的變化，結果見表4。

表4 蘋果酸-乳酸發酵前后抗氧化活性對比Table 4 Comparison of antioxidant activity before and after malolactic fermentation

由表4可知，當北五味子汁經過MLF后，DPPH自由基清除率是發酵前的1.22倍，還原力是發酵前的1.444倍，FRAP是發酵前的1.03倍，ABTS自由基清除率是發酵前的1.10倍。除還原力提高不顯著外（P＞0.05），其余均顯著性提高（P＜0.01）。

當北五味子汁經過MLF后，酚酸物質含量有所增加，由于在酚酸分子結構上的羥基具有較強的還原力與親核力，使得其具備了抗氧化活性，其分子中羥基的數量決定了其抗氧化能力的高低[20]；不僅如此，經過MLF發酵后，部分黃酮類化合物的含量也會有所增加，而存在于北五味子汁中的一些游離花色苷可以與其他多酚類物質相結合而產生的輔色素同樣使得北五味子汁黃酮類化合物的含量增加。因此，MLF可通過提高北五味子汁中黃酮類物質的含量來發揮對人體有益的作用。

需要進一步探究的是，有大量的多酚類物質、非多酚類物質、礦物質和酶存在于北五味子中，酒酒球菌究竟是如何與這些物質相互作用的還有待研究。

3 結論

在北五味子汁蘋果酸-乳酸發酵過程中，發酵溫度、發酵時間、初始pH會對其降酸工藝有一定影響，可以通過蘋果酸的降解率判定降酸效果；通過響應面優化可以得出最優工藝條件為酒酒球菌接種量7%、發酵溫度24 ℃、發酵時間8 d、初始pH 3.4。此優化條件下，北五味子汁經過蘋果酸-乳酸發酵后，蘋果酸降解率為59%。通過對比北五味子汁蘋果酸-乳酸發酵前后的抗氧化指標，得出北五味子汁通過蘋果酸-乳酸發酵更有利于其抗氧化活性成分的保持與提高抗氧化能力。