響應面試驗優化桑葚果酒發酵工藝及其品質分析

吳 均，黃傳書*，趙 珮，劉 艷

（重慶市蠶業科學技術研究院，重慶 400700）

桑葚（Fructus mori）是桑科桑屬多年生木本植物桑樹的果實，未成熟時為綠色，逐漸成長變為白色、紅色，成熟后為紫紅色或紫黑色，味酸甜。我國果桑廣泛分布于全國各地，品種70余種[1-2]，產量位居世界前列[3-4]。桑葚富含糖、蛋白質、脂肪酸、粗纖維、果膠、維生素、桑色素、花色苷、白藜蘆醇、鞣質、蘆丁等成分，花青素含量是藍莓的3倍、白藜蘆醇含量是葡萄的5倍[5]，具有抗氧化、抗衰老、抑制動脈粥樣硬化和抑制有害物質的生成的作用[6-10]，其營養豐富并具有藥用價值，于1993年被國家衛生部確定為藥食同源的水果[11]。目前桑葚一般以鮮食為主，市面上桑葚的加工制品主要有桑葚干、桑葚果汁[12]、桑葚醋[13]、桑葚粉[14]、桑葚膏[15]和桑葚酒[16]等，雖然對桑葚的研究越來越多，但總體來說其利用率并不高，原料浪費問題依然嚴重。將易腐敗變質、易損壞、易霉變的桑葚制成果酒，既能解決其保藏問題和避免浪費，又能延長果桑的產業鏈，提高果桑附加值，增加收入，還可豐富市面上果酒的種類。

隨著生活水平的不斷提高，人們越來越青睞具有保健和美容功效的低度發酵果酒，研究發現，桑葚果酒的保健功能及營養均高于葡萄酒，桑葚果酒中花色苷的含量是葡萄酒的5倍，蛋白質的含量是葡萄酒的8倍，硒元素含量是葡萄酒的12倍，白黎蘆醇含量高達1.38 μg/mL[17-19]。桑葚酒的發展時間較短，還需在廣度和深度方面進行大量的研究，以提高桑葚果酒的品質，改變市面上現有桑葚果酒品質不穩定、質量良莠不齊的現狀。本研究以桑葚為原料，以桑葚果酒的花色苷含量和酒精度為評價指標，對桑葚果酒的發酵工藝進行優化，旨在得到最佳桑葚果酒的發酵工藝參數，既能保證果酒的酒精度，又能降低果酒釀造過程中花色苷含量的損失，為釀造富含功能成分的桑葚果酒提供科學依據和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

桑葚（可溶性固形物含量為10.2%，總酸含量為5.22 g/kg，pH值為4.20，總糖含量為86.69 g/L）：采于重慶市蠶業科學技術研究院；RW酵母：安琪酵母股份有限公司；果膠酶（10萬U/g）：美國Solarbio公司；檸檬酸（分析純）：濰坊英軒實業有限公司；焦亞硫酸鉀（食品級）：浙江一諾生物科技有限公司；白砂糖（食品級）：廣西東亞扶南精糖有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical，DPPH）自由基：日本東京化成工業株式會社；2,2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（2,2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid），ABTS）自由基、維生素C（vitamin C，VC）：北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設備

H-200原汁機：上海韓惠人愛家電科技有限公司；HH-S8A恒溫水浴鍋：北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C pH計：上海雷磁儀器有限公司；PAL-α手持便攜式折光儀：日本愛拓公司；HPX-Ⅱ-400生化培養箱：上海躍進儀器有限公司；Ultra-3600 紫外可見光分光光度計：北京普源精電科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 桑葚果酒釀造工藝流程[20]

1.3.2 操作要點

冷凍桑葚解凍、榨汁：新鮮采摘的桑果經過挑選之后放入-18 ℃冰箱保存，解凍后的桑葚通過原汁機進行榨汁得到桑葚果汁。

酶解、過濾：在桑葚果汁自然pH條件下，加入0.1%的果膠酶，攪拌均勻，于50 ℃水浴中酶解處理120 min 并于90 ℃條件下滅酶3 min。將滅酶后的果汁通過200目的濾網袋進行過濾。

調pH、調糖：原汁中添加檸檬酸將pH值調整為3.8。原汁添加白砂糖為了提高糖度，保證果酒達到一定酒精度。

添加偏重亞硫酸鉀：原汁中添加偏重亞硫酸鉀使得SO2的質量濃度為100 mg/L，可起到殺菌、抗氧化和護色的作用。

酵母活化：稱取1 g RW酵母于20 mL 5%葡萄糖溶液中，攪拌均勻后于38 ℃活化30 min備用[21]。

發酵：將調整好成分、添加了偏重亞硫酸鉀和酵母的桑葚原汁裝入消毒后的自動排氣發酵瓶，置于26 ℃恒溫發酵3 d達旺盛階段，液面有大量泡沫和蛋白質組成的泡蓋；發酵7 d時液體逐漸澄清，總糖降至3 g/L左右時，此時發酵接近終點。根據液體澄清并再無小氣泡不斷從底部產生和測定總糖含量來確定發酵達到終點。

過濾：上層果酒用虹吸管抽取至玻璃瓶中，下層果酒用300目的濾網袋進行過濾。

滅菌：將果酒置于60 ℃的水浴鍋中水浴20 min，冷卻后即得桑葚果酒。

1.3.3 檢測方法

糖度：手持便攜式折光儀測定；pH：pH計測定；總糖：蒽酮-硫酸法[22]測定；酒精度：按照GB/T15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計法進行測定；花色苷：pH示差法[23]測定；菌落總數測定、大腸菌群測定、沙門氏菌檢測、金黃色葡萄球菌檢測按照文獻[24-27]中的方法測定。

1.3.4 桑葚果酒發酵工藝條件優化單因素試驗設計

在初始糖度分別為20°Bx、22°Bx、24°Bx、26°Bx、28°Bx，初始pH值分別為3.4、3.6、3.8、4.0、4.2，SO2質量濃度分別為60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L、120 mg/L、140 mg/L，酵母接種量分別為0.06 g/L、0.08 g/L、0.10 g/L、0.12 g/L、0.14 g/L，發酵溫度分別為22 ℃、24 ℃、26 ℃、28 ℃、30 ℃，發酵時間分別為2 d、4 d、6 d、7 d、8 d、9 d、10 d條件下制備桑葚果酒，考察初始糖度、初始pH、SO2質量濃度、酵母接種量、發酵溫度、發酵時間對桑葚果酒花色苷含量和酒精度的影響。

1.3.5 桑葚果酒發酵工藝條件優化響應面試驗

以單因素試驗的結果為依據，選擇對結果影響較大的發酵溫度（A）、發酵時間（B）、初始糖度（C）和酵母接種量（D）為自變量，以桑葚果酒花色苷含量（Y）為響應值，采用響應面法進行優化，篩選出桑葚果酒最佳發酵工藝條件，Box-Behnken試驗設計因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Benhnken experiment design

1.3.6 桑葚果酒抗氧化活性分析

（1）DPPH自由基清除率[28]

分別取0.04 mL、0.06 mL、0.08 mL、0.10 mL、0.12 mL、0.14 mL、0.16 mL、0.18 mL果酒于試管中，用純水補充至2mL，加入0.2mmol/LDPPH溶液2mL搖勻，避光放置30 min，于波長517nm處測定吸光度值Ai。同時測定0.04mL、0.06mL、0.08 mL、0.10 mL、0.12 mL、0.14 mL、0.16 mL、0.18 mL的果酒與無水乙醇各2 mL混合后的吸光度值Aj，以及無水乙醇與0.2 mmol/L DPPH溶液各2 mL混合后的吸光度值Ac；以0.2 mg/mL的VC作陽性對照。DPPH自由基清除率計算公式如下：

（2）ABTS+自由基清除率[29]

分別取0.05 mL、0.10 mL、0.15 mL、0.20 mL、0.25 mL、0.30 mL、0.35 mL的果酒于試管中，用純水補充至2 mL，加入ABTS+工作液2 mL，搖勻，避光放置30 min，于波長734 nm處測定吸光度值Ai；以純水替代樣品為空白對照，測得吸光度值為A0；以0.2 mg/mL的VC作陽性對照。ABTS+自由基清除率計算公式如下：

1.3.7 數據處理

3次重復試驗計算平均值；采用Origin 9.0和Design Expert 8.0.6進行繪圖和響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 初始糖度對桑葚果酒花色苷含量和酒精度的影響

圖1 初始糖度對果酒花色苷含量和酒精度的影響Fig.1 Effects of initial sugar concentration on anthocyanin and alcohol content in mulberry wine

由圖1可知，當初始糖度＜24°Bx時，隨著糖度的增加，花色苷含量和酒精度上升，當初始糖度＞24°Bx時，隨著糖度的增加，酒精度和花色苷含量下降。當初始糖度較低時，由于酵母增殖需要消耗一定的糖，使得用于發酵的糖不足而導致酒精度較低；當初始糖度過高時，又抑制了酵母的生長和繁殖，使得發酵不完全，由糖轉變為酒精較少，殘糖量過高。綜合考慮，桑葚果酒的最佳初始糖度為24°Bx。

2.1.2 初始pH值對桑葚果酒花色苷含量和酒精度的影響

圖2 初始pH值對果酒花色苷含量和酒精度的影響Fig.2 Effects of initial pH on anthocyanin and alcohol content in mulberry wine

在適宜微酸性環境下，酵母菌生長、繁殖和發酵都很迅速，且花色苷在pH 2～4之間最穩定。由圖5可知，pH＜3.8時，花色苷含量和酒精度隨pH值增加而升高，pH＞3.8時，花色苷含量和酒精度隨初始pH增加而降低，酵母的生長繁殖受到了抑制，花色苷也越來越不穩定。綜合考慮，桑葚果酒的最佳初始pH值為3.8。

2.1.3 SO2質量濃度對桑葚果酒花色苷含量和酒精度的影響

圖3 SO2添加量對果酒花色苷含量和酒精度的影響Fig.3 Effects of sulfur dioxide addition on anthocyanin and alcohol content in mulberry wine

適宜的SO2質量濃度不僅能抑制雜菌生長，也能起到護色和抗氧化的作用，進而提高果酒的品質；過高的SO2質量濃度不僅會使原汁中的酸度上升導致酵母發酵緩慢，又使桑葚的顏色變淺[34-35]；過低的SO2質量濃度不能抑制雜菌生長，使得果酒發酵不完全而變得渾濁。由圖3可知，在發酵過程中，SO2質量濃度對果酒酒精度和花色苷含量影響不顯著，隨著SO2質量濃度的升高，花色苷含量增加，說明SO2對花色苷具有保護作用。綜合考慮，桑葚果酒的最佳SO2質量濃度為100 mg/L。

2.1.4 酵母接種量對桑葚果酒花色苷含量和酒精度的影響

圖4 果酒酵母接種量對果酒花色苷含量和酒精度的影響Fig.4 Effect of yeast inoculum on anthocyanin and alcohol content in mulberry wine

由圖4可知，酵母接種量＜0.10 g/L時，隨接種量的增加，桑葚果酒花色苷含量和酒精度不斷增加；酵母接種量＞0.10 g/L時，隨接種量的增加，桑葚果酒花色苷含量和酒精度不斷減少。酵母接種量較少時，果酒發酵不徹底，果酒的酒精度不高且花色苷溶出含量較少；酵母接種量較大時，桑葚果酒花色苷含量和酒精度都較低的原因在于酵母自身大量繁殖和代謝產生的物質使得酒精轉化受到抑制，且酵母的細胞壁又能夠吸附花色苷從而降低果酒中花色苷的含量[30]。綜合考慮，桑葚果酒的最佳酵母接種量為0.10 g/L。

2.1.5 發酵溫度對桑葚果酒花色苷含量和酒精度的影響

圖5 發酵溫度對果酒花色苷含量和酒精度的影響Fig.5 Effects of fermentation temperature on anthocyanin and alcohol content in mulberry wine

發酵溫度過低，酵母生長緩慢，酶活低下，酒精和香氣成分積累不足，風味平淡[31]；溫度過高不僅使得酵母容易提早衰老，又產生大量副產物，造成果酒的風味不佳，口感品質降低[32-33]。由圖5可知，隨著發酵溫度的上升，桑葚果酒花色苷含量和酒精度呈現先上升后降低的變化趨勢，發酵溫度為26 ℃時，果酒花色苷含量和酒精度達到最大值；發酵溫度高于26 ℃時，酵母過度繁殖大量消耗糖分，酒精度低下，花色苷分解加快。綜合考慮，桑葚果酒的最佳發酵溫度為26 ℃。

2.1.6 發酵時間對桑葚果酒花色苷含量和酒精度的影響

圖6 發酵時間對果酒花色苷含量和酒精度的影響Fig.6 Effect of fermentation time on anthocyanin and alcohol content in mulberry wine

由圖6可知，隨著發酵時間延長，桑葚果酒花色苷含量和酒精度逐漸增加，第8天時，花色苷含量和酒精度達到最高值，分別為166.66 mg/L和12.4%vol，8 d后逐漸降低。發酵液中的花色苷隨著酒精度的增加而不斷溶出，在發酵前期花色苷含量逐漸增加，8 d后花色苷含量逐漸降低，可能是因為花色苷不穩定分解所致。綜合考慮，桑葚果酒的最佳發酵時間為8 d。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果與方差分析

在單因素試驗基礎上，選擇發酵溫度（A）、發酵時間（B）、初始糖度（C）和酵母接種量（D）為自變量，以桑葚果酒花色苷含量（Y）為響應值，采用響應面法進行優化，篩選出桑葚果酒最佳發酵工藝條件，試驗設計及結果見表2，方差分析結果見表3。

采用Design-expert 8.0.6分析軟件對表2試驗結果進行多元回歸分析，得到預測模型回歸方程如下：

Y=211.79+1.73A+1.59B+4.33C-0.42D-1.55AB-6.03AC-4.59AD-7.09BC-0.76BD+3.73CD-20.46A2-22.87B2-13.72C2-22.16D2

表2 Box-Behnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiments

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，該模型極顯著（P＜0.000 1），失擬項不顯著（P=0.099 8＞0.05），說明該模型擬合度較好，得到的方程能很好地預測結果[36]。一次項C、交互項AC、AD、BC、二次項A2、B2、C2、D2對桑葚果酒花色苷含量的影響極顯著（P＜0.01），說明它們對響應值的影響比較復雜，不僅是簡單的線性關系。決定系數R2=0.913 7，調整決定系數R2adj=0.967 9，說明該模型能解釋96.79%的變化，擬合度較好，因此能用此模型對桑葚果酒發酵工藝進行分析和預測。由方差分析可知，4個因素對響應值的影響順序為：初始糖度（C）＞發酵溫度（A）＞發酵時間（B）＞酵母接種量（D）。

2.2.2 響應面交互作用

三維圖和等高線能夠預測和檢驗自變量的響應值及自變量之間的關系[37]。由圖7可知，AC、AD、BC的等高線呈橢圓形，說明兩者交互作用對花色苷含量的影響大，達到極顯著效果，CD的等高線呈近似橢圓形，說明交互作用達到顯著效果，AB、BD的等高線呈圓形，說明兩者有交互作用，但是兩者交互不顯著。

經系統分析得到桑葚果酒最佳工藝條件為發酵時間8.02 d、發酵溫度26.02 ℃、初始糖度24.30°Bx、酵母接種量0.10 g/L，桑葚果酒花色苷含量預測值為212.14 mg/L；為了方便操作，將最佳工藝條件調整為發酵時間8 d、發酵溫度26 ℃、初始糖度24.5°Bx、酵母接種量為0.10 g/L。在此優化發酵工藝條件下進行3次平行驗證試驗，得到花色苷含量實際值為208.79 mg/L，實際值與預測值相差不大，表明該工藝可行。

圖7 各因素交互作用對花色苷含量影響的響應面及等高線Fig.7 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on anthocyanin content

2.3 桑葚果酒品質分析

該工藝條件下發酵得到的桑葚果酒呈紫紅色、澄清透明，酒香馥郁，口感柔和，帶有明亮的桑葚果香風味。酒精度為12%vol、總糖含量為3～5 g/L、菌落總數＜1 CFU/mL、大腸菌群＜3.0 MPN/100 mL、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等未檢出。

2.4 桑葚果酒抗氧化性結果

圖8 桑葚果酒的DPPH（A）及ABTS（B）自由基清除率Fig.8 DPPH (A) and ABTS (B) free radical scavenging capacity of mulberry wine

由圖8A可知，樣品體積＜0.10 mL時，DPPH自由基清除率隨樣品量的增加而增加；當樣品體積為0.10 mL時，桑葚果酒和VC溶液的DPPH自由基清除率分別為95.55%和97.16%；樣品體積＞0.10 mL時，桑葚果酒和VC溶液對DPPH自由基的清除率的增長緩慢。相同體積的桑葚果酒的DPPH自由基的清除能力要低于VC溶液。

由圖8B可知，樣品體積＜0.20 mL時，ABTS自由基清除率隨樣品量的增加而增加；當樣品體積為0.2mL時，桑葚果酒和VC溶液的ABTS自由基清除率分別為97.82%和98.34%；樣品體積＞0.20 mL時，桑葚果酒和VC溶液對ABTS自由基的清除率的增長緩慢。相同體積的桑葚果酒的ABTS自由基的清除能力要低于VC溶液。

3 結論

通過響應面分析法得到桑葚果酒的最佳發酵工藝條件：發酵時間8 d、發酵溫度26 ℃，初始糖度24.5°Bx，酵母接種量0.10 g/L。在此優化條件下，桑葚果酒花色苷含量可達208.79 mg/L。表明該模型擬合程度良好，能用此模型對桑葚果酒花色苷含量進行分析和預測，其殘留總糖量為3.1 g/L，酒精度為12.7%vol，菌落總數＜1 CFU/mL、大腸菌群＜3.0 MPN/100 mL、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌未檢出，桑葚果酒的DPPH、ABTS自由基最大清除率為95.55%、97.82%。