鄂爾多斯鈍頂螺旋藻毒性評價

王志忠，孫君社，穆 潔，鞏東輝，包玉蘭，喬 辰

（1.農業農村部規劃設計研究院，北京 100125；2.鄂爾多斯市新宇力藻業集團有限公司，內蒙古 鄂爾多斯 016199；3.鄂托克旗螺旋藻工程技術研究中心，內蒙古 鄂爾多斯 016199；4.內蒙古科技大學 生命科學與技術學院，內蒙古 包頭 014010；5.鄂托克旗園林綠化中心，內蒙古 鄂爾多斯 016199）

螺旋藻也被稱作節旋藻，是屬于藍藻門、藻殖段綱、顫藻科、螺旋藻屬（節旋藻屬）的一類原始生物[1-3]。人們已經發現30多個螺旋藻種[4]。目前中國允許產業化的螺旋藻種只有鈍頂螺旋藻和極大螺旋藻[5-6]。

螺旋藻因其能量低、蛋白質適中、脂肪、碳水化合物含量低的特性以健康食品的形式進入人們的餐桌，在最少的脂肪、碳水化合物及能量攝入前提下補充優質蛋白質[7-8]，提高人們的免疫力[9-10]、抗感染力[11-13]、抗病毒力[14]，也可避免肥胖[15-16]和高血壓等慢性病[17]。螺旋藻含有藻藍蛋白、多糖、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、γ-亞麻酸、葉綠素等具有改善健康功能的多種有用物質[18-22]。

內蒙古鄂爾多斯市鄂托克旗部分企業從2002年開始養殖螺旋藻，產量逐年增加，生產工藝不斷優化和改善，產品質量不斷提升[23]。2010年，鄂托克旗螺旋藻產業園建立后，26家企業全部入駐螺旋藻產業園區。現園區年生產螺旋藻粉3 500 t，占國內螺旋藻粉產量的40%以上[24]。為推動當地螺旋藻獲得保健功能認證，按照《保健食品注冊與備案管理辦法》（國家食品藥品監督管理總局令第22號）要求，注冊保健食品要求提供毒理學試驗報告，對產品進行安全性評價，研究了鄂爾多斯鈍頂螺旋藻急性毒性、小鼠骨髓細胞微核試驗、Ames試驗、小鼠精子畸形試驗，評價鄂爾多斯鈍頂螺旋藻攝入的危險性，為保健食品劑量設計提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

墨綠色螺旋藻：產自鄂爾多斯市新宇力藻業公司，粉碎，研磨過55目篩備用。試驗所用美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠：來自于浙江省試驗動物中心，屬清潔級，試驗動物生產許可證號編號為SCXK（浙）2008-0033，試驗動物使用許可證編號為SYXK（浙）2005-0074。試驗動物所用飼料來自于浙江省試驗動物中心，執行標準為GB 14924—2010《實驗動物配合飼料營養成分》。檢測環境溫度為20～25 ℃，相對濕度為40%～70%。在試驗前所有試驗動物均在動物房設定環境條件下適應3 d。

鼠傷塞沙門氏菌（組氨酸營養缺陷型）四株：TA97a、TA98、TA100、TA102，來自于上海市疾病預防控制中心，經生物學試驗鑒定為合格。

羧甲基纖維素、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、疊氮鈉、敵克松、2-乙酰氨基芴、1,8-二羥基蔥醌、S9、環磷酰胺、甲醇、Giemsa、絲裂霉素C、伊紅等試劑（分析純）：上海起發實驗試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

奧林巴斯CX21顯微鏡：奧林巴斯（北京）銷售服務有限公司；JOYNTYJS-Ⅱ菌落計數器：上海喬越電子科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠急性經口毒性試驗

選用雌雄各10只健壯、成熟的美國癌癥研究所（institute of cancer research，ICR）小鼠，體質量應為18～22 g 之間。遵從最大耐受量試驗的要求，設置20.0 g/kg小鼠重量試驗劑量組，稱取螺旋藻樣品20 g，以1%濃度的羧甲基纖維素為溶媒配制40 mL樣品混懸液。對雌雄各10只小鼠按20 mg/kg體質量灌胃容量灌胃（灌胃前停止供食16 h），間隔6 h后同灌胃容量條件下二次灌胃。觀察記錄試驗小鼠灌藥后的基本狀況、中毒的情況基表現以及死亡狀況，觀察時長設置為7 d。

1.3.2 Ames試驗

試驗采用平板摻入的方法。準確稱取鈍頂螺旋藻樣品0.50 g用DMSO研磨稀釋到10.0 mL，在0.103 MPa壓力條件下滅菌20 min，備用。用非代謝活化的TA100菌株系統開展預備試驗，5 000 μg/皿劑量未出現明顯的增菌和抑菌情況，在正式試驗過程中選取8 μg/皿、40 μg/皿、200 μg/皿、1 000 μg/皿、5000 μg/皿五個劑量組設定為試驗的濃度，對照組為空白、溶劑和陽性組（疊氮鈉、敵克松、2-乙酰氨基芴與1,8-二羥基蔥醌），每一種試驗菌株的每一個試驗濃度均設置三皿平行，均在加與不加S9的條件下開展試驗。試驗均重復一次。直接計數培養基上的各個菌株發生的回變菌落數。

1.3.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

將體質量均在25～28 g之間的小鼠隨機分成三個劑量組：2.5、5.0、10.0 g/kg體質量，分別稱取試驗螺旋藻樣品2.5 g、5.0 g、10.0 g，配制20 mL混懸液，以1%羥甲基纖維素為溶媒。一個陰性對照組用1%濃度羥甲基纖維素，一個陽性對照組用40 mg/kg體質量環磷酰胺，每組選取10只小鼠，雄雄各5只。對小鼠間隔24 h分別灌胃2次，灌胃容量為20 mL/kg體質量，第二次灌胃后6 h將試驗小鼠脫臼處死。用小鼠胸骨的骨髓制骨髓片，用甲醇溶液進行固定，然后采用Giemsa染色。在顯微鏡檢時，分別對每只小鼠計數1 000個嗜多染紅細胞，計算其微核千分率和PCE/NCE數值。

1.3.4 小鼠精子畸形試驗

將25只體質量在25～30 g之間的ICR雄性小鼠隨機分為三個劑量組：分別為2.5、5.0、10.0 g/kg體質量，然后分別稱取試驗樣品5.0、10.0、20.0 g，配制成40 mL混懸液，以1%羧甲基纖維素為溶媒。設置一個陰性對照組：1%羧甲基纖維素，一個陽性對照組：1.5 mg/kg體質量絲裂霉素C，每組選取5只小鼠。用灌胃方式給予樣品，灌胃容量為20 mL/kg小鼠體質量，連續灌胃5 d，毎天一次，給予對照組同樣處理。首次灌胃后第35天將試驗小鼠脫臼處死，在取得每組試驗小鼠的兩側附睪后，用吸濾液制片，在自然條件下干燥，用甲醇溶液固定，采用1%伊紅染色后，備用。用高倍顯微鏡觀察涂片上精子的形態，對每只小鼠均計數完整精子1 000條，并計算發生畸形精子的百分數（%）。

2 結果與分析

2.1 小鼠急性經口毒性試驗

試驗小鼠死亡的統計結果見表1。在整個試驗期限內，所有試驗小鼠均未發現明顯中毒癥狀和死亡現象。鄂爾多斯鈍頂螺旋藻對試驗雌雄小鼠經口最大耐受量（maximum-tolerated dose，MTD）都不小于20 g/kg體質量，故此鄂爾多斯鈍頂螺旋藻樣品屬于無毒級。

表1 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻小鼠經口急性毒性死亡情況Table 1 Oral acute toxicity death of Spirulina platensis from Ordos in mice

2.2 Ames試驗

表2 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻Ames試驗結果Table 2 Result of Ames tests of Spirulina platensis from Ordos

續表

表3 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻Ames試驗重復試驗結果Table 3 Result of repeated Ames test of Spirulina platensis from Ordos

表2、表3為各試驗菌株的回變菌落數。由表2和表3可知，無論加與不加S9，各濃度受試物回變菌落數均與陰性對照試驗組結果趨于近似，而各陽性對照回變菌落數均超過陰性對照回變菌落數2倍以上。鄂爾多斯鈍頂螺旋藻Ames試驗結果呈陰性。

2.3 小鼠骨髓細胞微核試驗

鄂爾多斯鈍頂螺旋藻樣品對試驗小鼠骨髓細胞微核率的影響情況見表4。

表4 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻對小鼠微核的影響Table 4 Effect of Spirulina platensis from Ordos on micronucleus in mice

由表4可知，運用卡方檢驗對數據進行統計，各試驗劑量組的微核千分率與陰性對照組相比均無顯著差異（P＞0.05），而陽性試驗對照組骨髓細胞微核率則極顯著超過陰性試驗對照組（P＜0.01）。試驗數據表明鄂爾多斯鈍頂螺旋藻樣品對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核率無顯著影響。

2.4 小鼠精子畸形試驗

鄂爾多斯鈍頂螺旋藻樣品對試驗小鼠精子發生畸形比率的數據見表5。各劑量組試驗小鼠精子畸形發生率與陰性對照組比較均無顯著性差異（P＞0.05），而陽性試驗對照組小鼠精子畸形發生率則極顯著高于陰性對照組（P＜0.01），數據表明鄂爾多斯鈍頂螺旋藻樣品對小鼠精子畸形發生率無顯著影響（P＞0.05）。

表5 鄂爾多斯鈍頂螺旋藻對小鼠精子畸形發生率的影響Table 5 Effect of Spirulina platensis from Ordos on the incidence of sperm abnormalities in mice

3 討論

鄂爾多斯鈍頂螺旋藻其藻種也來自于當地堿湖，雖然藻種經鑒定屬于鈍頂螺旋藻品系，且針對鈍頂螺旋藻的營養和功能已有多項研究成果，但其畢竟為一中國新記錄種[23]，其毒理學試驗并未開展，其安全性也未得到驗證，所以對鄂爾多斯鈍頂螺旋藻開展急性毒性試驗非常必要。

試驗結果表明，鄂爾多斯鈍頂螺旋藻對雌雄小鼠經口MTD均大于20 g/kg體質量，屬于無毒級產品，且證明對試驗小鼠沒有發生突變，對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核百分率也未見明顯的影響，對試驗小鼠精子發生畸形比率無顯著影響，可以證明鄂托克旗產鈍頂螺旋藻無急性毒性。這與李曉玉等[25]檢測的北海生巴達生物科技有限公司提供螺旋藻粉的急性毒性檢測結果相同。李鳳文等[26]對昆明某技術有限公司提供的螺旋藻精片開展了急性毒性、Ames、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗，也得出了無毒性、無致突變等與本研究一致性的結果。本研究結果與劉用國等[27]對福清市新大澤產螺旋藻粉對小鼠急性毒性的研究結果也相一致，由此可見，內蒙古鄂托克旗產鈍頂螺旋藻的急性毒性、致突變和致畸的結果與廣西、云南、福建產螺旋藻的結果相一致，說明此四地的螺旋藻基本毒理學屬性相一致，但廣西、云南、福建螺旋藻是否為鈍頂螺旋藻且其是否產自上述三地均有待于進一步考證和驗證。從上述試驗結果來看，鄂托克旗產鈍頂螺旋藻是無毒和無致突變的，可以作為人們放心食用的食品或保健食品。

4 結論

鄂爾多斯鈍頂螺旋藻小鼠經口急性毒性最大耐受量（MTD）都大于20.0 g/kg體質量（雌雄兩性別），根據急性毒性分級的判定標準進行判定，本試驗受試樣品應屬于無毒級別；Ames試驗、小鼠骨髓細胞微核試驗與小鼠精子畸形試驗結果都為陰性，顯示在本次試驗設定的條件下，鄂爾多斯鈍頂螺旋藻未顯示有致突變性和致精子畸形特性。