響應面優化香菇柄發酵醬糕的制曲工藝

程洋洋，惠靖茹，郝競霄，黃占旺*

（江西農業大學 食品科學與工程學院 江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045）

香菇（Lentinus edodes）屬于真菌門擔子菌亞門傘菌目口蘑科香菇屬[1]，在食用菌種植上是全球第二大品種[2]。肉質肥厚細嫩、香氣濃郁、營養豐富而廣受人們喜愛，是一種藥食同源的食物，具有抗氧化、預防種瘤、增強機體免疫力、降血脂、抗血栓、健脾保肝、預防佝僂病及貧血等功效，是我國久負盛名的食用菌[3]。但在日常生活和加工生產過程中，常將香菇柄丟棄，造成資源上的巨大浪費。香菇柄重量約占香菇總質量的25%～30%，因其含有大量的膳食纖維，直接食用不僅難以咀嚼，并且不利于消化吸收，但將香菇柄進行發酵后制作成醬糕，不僅保留了營養成分還賦予了其特殊的風味物質[10-11]。

香菇柄發酵醬糕是以黃豆、糯米、香菇柄粉為原料制成的香菇醬，經過后續添加一些其他的食品原料制成的一種供人們食用的糕點，不但營養豐富而且風味獨特，含有蛋白質、多肽、維生素等對人體有益的生理活性物質，具有一定的保健功能。香菇柄發酵醬糕是一種新型食品，具有廣闊的市場前景。制曲是保證醬糕產品品質的第一個關鍵點，因此，研究制曲過程是有必要的。

試驗以糯米、黃豆為原料，米曲霉為發酵菌種進行香菇柄發酵醬糕的制曲，以蛋白酶活力、淀粉酶活力、纖維素酶活力的大小為評價指標[12]，通過單因素試驗和響應面優化試驗挑選出制曲的最優條件，旨在為生產品質優異的香菇柄發酵醬糕提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃豆：贛州康瑞農產品有限公司；米曲霉（Aspergillus oryzae）As3.042：濟寧玉園生物科技有限公司；糯米：市售；可溶性淀粉：西隴化工股份有限公司；福林酚、干酪素、3,5二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）試劑：北京索萊寶科技有限公司；羧甲基纖維素鈉：上海展云化工有限公司。

1.2 儀器與設備

MHP-250型霉菌培養箱：上海三發科學儀器有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器、LDZM立式壓力蒸汽滅菌器、GZX-9070MBE電熱鼓風干燥箱：上海博訊醫療生物儀器股份有限公司；JH2102電子天平：上海精密科學儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 制曲工藝

黃豆與糯米按照一定的比例混合，浸泡12 h后撈出瀝干水分，在121 ℃高壓滅菌鍋中滅菌15 min，取出后攤開放置于桌面自然冷卻至30 ℃以下，接種一定比例的米曲霉As3.042，隨后放入霉菌培養箱中恒溫培養至制曲結束，在此期間翻曲1次，防止米曲霉As3.042在曲料上生長不均勻影響成曲品質。

1.3.2 單因素試驗

（1）原料比對制曲的影響：設定糯米黃豆質量比分別為1∶0、4∶1、3∶2、2∶3、1∶4。原料混勻后浸泡12 h撈出瀝干水分，在121 ℃高壓滅菌鍋中蒸煮15 min，取出冷卻至30 ℃以下，接入0.7%的米曲霉As3.042，霉菌培養箱中30 ℃培養48 h后取出，在40 ℃的烘箱內烘干后粉碎測定酶活力。

（2）接種量對制曲的影響：設定米曲霉接種量分別為0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、1.0%[13]。糯米黃豆原料比為2∶3，原料混勻后浸泡12 h撈出瀝干水分，在121 ℃高壓滅菌鍋中蒸煮15 min，取出冷卻至30 ℃以下，接入不同比例的米曲霉As3.042，霉菌培養箱中30 ℃培養48 h后取出，在40 ℃的烘箱內烘干后粉碎測定酶活力。

（3）培養時間對制曲的影響：設定培養時間分別為12 h、24 h、36 h、48 h、60 h。糯米黃豆原料比為2∶3，原料混勻后浸泡12 h撈出瀝干水分，在121 ℃高壓滅菌鍋中蒸煮15 min，取出冷卻至30 ℃以下，接入0.7%的米曲霉As3.042，霉菌培養箱中30 ℃培養不同時間后取出，在40 ℃的烘箱內烘干后粉碎測定酶活力。

（4）培養溫度對制曲的影響：設定培養溫度分別為22℃、26 ℃、30 ℃、34 ℃、38 ℃。糯米黃豆原料比為2∶3，原料混勻后浸泡12 h撈出瀝干水分，在121 ℃高壓滅菌鍋中蒸煮15 min，取出冷卻至30 ℃以下，接入0.7%的米曲霉As3.042，霉菌培養箱不同溫度下培養48 h后取出，在40 ℃的烘箱內烘干后粉碎測定酶活力。

1.3.3 響應面優化試驗設計

表1 發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments for fermentation conditions optimization

根據單因素試驗選出的條件，對米曲霉接種量、培養時間、培養溫度3個因素，每個因素設置3個水平，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面優化試驗，進行采用響應面優化試驗中的ANOVA法對所得試驗數據進行方差分析，確定最佳制曲工藝條件，試驗因素水平表見表1。

1.3.4 試驗指標的測定

蛋白酶活力測定參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定》福林酚法相關步驟，只進行了中性蛋白酶的測定[14]；樣品中水分含量的測定按照國標GB 5009.3—2016《食品安全國家標準食品中水分的測定》中常壓干燥法測定[15]；淀粉酶活力測定采用DNS比色法進行測定[16]；纖維素酶活力的測定采用羧甲基纖維素鈉法[17]。

1.3.5 數據處理

采用Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面試驗設計和優化分析、SPSS 26進行試驗數據的統計與分析、Origin 2018進行繪圖處理。所有試驗重復3次。

2 結果與分析

2.1 制曲工藝優化單因素試驗

2.1.1 原料質量比對成曲酶活力的影響

米曲霉在生長過程中不僅會產蛋白酶，還可以產淀粉酶、纖維素酶，但本試驗成曲的品質主要由蛋白酶活力大小決定，因此在確定原料比時主要依照蛋白酶活力的大小。由圖1可以看出，當糯米與黃豆的質量比為2∶3時，成曲中蛋白酶活力達到峰值為3 260.44 U/g，此時淀粉酶活力與纖維素酶活力已經由峰值開始減小，但因這兩種酶對產品的品質影響較小。因此選用糯米與黃豆的比例為2∶3時制曲，可以獲得品質優異的成曲。

圖1 不同原料質量比對酶活力的影響Fig.1 Effect of different material mass ratios on enzyme activity

2.1.2 接種量對成曲酶活力的影響

由圖2可知，隨著米曲霉接種量的不斷增加，三種酶活力均呈現先增大后減小的趨勢。接種量為0.5%時，纖維素酶活力達到最大值為67.35 U/g，此時蛋白酶活力、淀粉酶活力還未達到峰值；當接種量為0.7%時，蛋白酶活力、淀粉酶活力最大為2 938.07 U/g和245.13 U/g。隨著接種量的繼續增加，酶活力都出現降低的趨勢，這是由于接種量過大時，米曲霉所需要的營養物質不能滿足自身的生長需要，進而影響后續的酶活力大小。因此在進行響應面試驗時選取米曲霉接種量為0.5%、0.7%、1.0%。

圖2 不同米曲霉接種量對酶活力的影響Fig.2 Effect of different inoculum of Aspergillus oryzae on enzyme activity

2.1.3 培養時間對成曲酶活力的影響

由圖3可知，培養時間在12～60 h之間時，蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶活力都隨培養時間的延長呈現出先增大后減小的規律，3種酶活都在培養時間在48 h達到峰值。當生長條件適宜的情況下，米曲霉生長旺盛，三種酶活力增強，隨著培養時間的延長，原料中的各種營養物質被消耗，菌絲體因缺乏營養物質逐漸開始衰退，代謝產物減少，三種酶活力達到最大值后便開始有所下降。為更準確地確定最優培養時間，選用44 h、48 h、52 h設計響應面試驗。

圖3 不同培養時間對酶活力的影響Fig.3 Effect of different culture time on enzyme activity

2.1.4 培養溫度對成曲酶活力的影響

溫度對酶活力的影響主要通過增加參與反應的生物大分子的能量，使一些原本未得到能量的生物大分子獲得能量變成活化分子，進而影響酶活力的大小[18]。當培養箱的溫度設置的過低時，酶雖然不會失活，但溫度對酶的鈍化作用使米曲霉的生長與新陳代謝活動減弱，從而酶活力變弱。過高的溫度對米曲霉生長與產酶的影響更大，甚至會直接導致酶的失活。從圖4可知，培養溫度在26～34 ℃區間時，三種酶活力都出現先增大后減小的趨勢，在溫度為30 ℃時三種酶活力均達到最大值分別為2 365.10 U/g、403.51 U/g、46.25 U/g。因此選擇26 ℃、30 ℃、34 ℃用于后續的響應面試驗。

圖4 不同培養溫度對酶活力的影響Fig.4 Effect of different culture temperature on enzyme activity

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗設計與結果

根據響應面Box-Behnben試驗的原理，選取米曲霉接種量（A）、培養時間（B）、培養溫度（C）為試驗因素，以蛋白酶活力（Y）大小為響應值進行響應面試驗設計，設計方案及結果如表2。

表2 發酵條件優化響應面試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of response surface methodology for fermentation conditions optimization

由于米曲霉接種量、培養時間、培養溫度對蛋白酶活的影響不是簡單的線性關系，因此對試驗所得數據進行了多元回歸分析，明確了米曲霉接種量（A）、培養時間（B）、培養溫度（C）三個因素對響應值蛋白酶活力（Y）的影響情況，分析后得到的回歸方程為：

Y=2 608.37+199.86A+117.00B-74.05C+41.24AB-84.99AC+176.45BC-348.41A2-114.52B2-128.09C2

2.2.2 模型方差分析

通過軟件Design-Expert 8.0.6對試驗結果進行了ANOVA方差分析，以驗證回歸模型與因素的顯著性，方差分析結果見表3。由表3可知，二次多項式回歸模型P＜0.000 1，R2=98.89%＞85%，說明該回歸模型極顯著、擬合程度很好，試驗誤差小，可用該回歸方程代替試驗真實點對香菇柄發酵醬糕的制曲試驗結果進行分析和預測。失擬項P=0.110 8＞0.05，說明失擬項不顯著。根據回歸方程方差分析表中的F值得大小可知3個因素對成曲蛋白酶活力的影響大小從大到小依次為：培養溫度（C）、米曲霉接種量（A）、培養時間（B）。一次項A對結果影響顯著（P＜0.05），一次項C對結果影響極顯著（P＜0.01）。交互項AB、AC、BC對酶活的影響均不顯著（P＞0.05），但平方項A2、B2、C2影響極顯著（P＜0.000 1）。

表3 回歸方程方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

2.2.3 響應面分析

米曲霉接種量、培養時間、培養溫度的交互效應及等高線見圖5。響應面3D圖可以比較直觀的分析蛋白酶活力大小隨著三因素的變化情況，響應面越陡則說明該試驗中的某個因素對蛋白酶活力的影響越大，響應面3D圖投影下的等高線越近似于一個橢圓形，那么就表示這兩個因素的交互作用越強[19]。根據模型方差分析中的F值與響應面分析可知，三個因素對蛋白酶活力的大小都有一定的影響。圖5a中，隨著米曲霉接種量和培養時間的增加，蛋白酶活力呈現先增大后減小的趨勢，且其二維等高線圖偏圓形，判斷米曲霉接種量和培養時間之間的交互作用不顯著；圖5b中，隨著米曲霉接種量和培養溫度的提高，蛋白酶活力呈現先增加后減小的趨勢，圖中的等高線圖呈橢圓形，說明米曲霉接種量和培養溫度之間存在一定的相互影響作用，但它們的交互作用不顯著；圖5c中，等高線圖偏橢圓形，表明兩個因素之間有一定的交互作用但不顯著，這與回歸方程方差分析的結果是一致的[20]。對響應面試驗模型進一步分析篩選，計算得到香菇柄發酵醬糕的最優制曲工藝條件為米曲霉接種量0.78%、培養時間48.02 h、培養溫度30.85 ℃，此條件下蛋白酶活力預測值為2 592.67 U/g。

圖5 各因素交互作用對蛋白酶活力影響的響應面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour lines of effects of interaction of each factor on protease activity

2.2.4 驗證試驗

根據試驗所需條件和實際的可操作性，調整修正后的香菇柄發酵醬糕制曲條件為：米曲霉接種量0.8%、培養時間48 h、培養溫度30 ℃。在此條件下進行3次重復性驗證試驗，對制曲試驗結果取平均值，得到香菇柄發酵醬糕成曲的蛋白酶活力為2 625.48 U/g，同模型預測值的相對誤差僅為1.27%（＜5%），說明響應面法對香菇柄發酵醬糕制曲的工藝條件優化具有實際可行性，可為后續實際生產應用提供一定的理論基礎[21]。

3 結論

本試驗首先依據蛋白酶活力、淀粉酶活力、纖維素酶活力的大小，采用單因素試驗確定了各個因素的最優范圍，采用響應面試驗對制曲的條件進行優化，以獲得品質符合要求的成曲。優化后得到香菇柄發酵醬糕的最佳制曲工藝為：在糯米和黃豆質量比2∶3、米曲霉接種量0.8%、培養時間48 h、培養溫度30 ℃，所得到的成曲蛋白酶活力為2 625.48 U/g，該成曲表面布滿黃綠色孢子，菌絲體生長良好，有明顯的曲香味，無雜菌生長和其他異味。