HemoCue@hb301儀檢測人血紅蛋白在現場調查中的適用性研究

王笑笑，馮欣宇，周水森，黃 芳

(1.中國疾病預防控制中心寄生蟲病預防控制所/世界衛生組織熱帶病合作中心/科技部國家級熱帶病國際聯合研究中心/衛生部寄生蟲病原與媒介生物學重點實驗室，上海 200025；2.浙江省疾病預防控制中心，杭州 310051)

血紅蛋白（hemoglobin,Hb）是脊椎動物體內負責運載氧的一種蛋白質，可通過平均細胞Hb 濃度測算其水平。人體內Hb含量相對穩定，但在某些病理或生理情況下可出現升高或降低，如瘧疾患者由于紅細胞破壞和生成受抑，其體內Hb含量通常低于正常人，常導致貧血。因此，在一些疾病的現場流行病學調查中，需要通過對患者的Hb含量進行測定，以評價疾病對健康的影響。因此，建立一種簡便快捷、適用性強的Hb含量現場檢測方法，對疾病的現場調查工作具有重要意義。

根據Hb 檢測原理的不同，常用方法主要分為四類：全血鐵法、比重折射儀法、血氣分析法和比色法。臨床常用比色法，包括氰化高鐵血紅蛋白（haemiglobincyanide;HiCN）比色法、十二烷基硫酸鈉血紅蛋白(SDS/SLS-Hb)法、堿羥血紅蛋白（AHD575）法、疊氮高鐵血紅蛋白（HiN3）和溴代十六烷基三甲胺（CTAB）血紅蛋白法等。其中HiCN 比色法是國際血液學標準化委員會（International Committee for Standardization of hematology，ICSH）、國際臨床化學聯合會（International Federation of Clinical Chemistry,IFCC）、國際病理學會（International Academy of Pathology,IAP）和世界衛生組織（World Health Organization,WHO）等推薦的標準檢測方法[1-2]，也是我國目前推薦的Hb含量檢測的參比方法[3]。盡管HiCN 法操作簡便、顯色快，但氰化鉀劇毒，廢棄物處理有難度，且高蛋白血癥時易渾濁，影響了該方法的廣泛應用[2]。隨后，又相繼研發出了不使用氰化鉀的其他方法，如目前臨床機構常用的血液自動分析儀多為SDS/SLS-Hb 法，便攜式的HemoCue@hb301 儀（以下簡稱HemoCue 儀）為HiN3 法。目前，HemoCue 儀在國際上有較廣泛的應用，有學者將其應用于ICU病人的Hb快速檢測[4]，也有的應用于移動獻血車上Hb水平的快速篩查[5]。

盡管血液自動分析儀測定為目前臨床常用的方法，結果也相對準確，但由于疾病的現場流行病學調查常需要深入山區或邊遠地區，儀器設備配置不理想，血液采集、運輸和儲存條件也有限，使血液自動分析儀的現場應用存在一定的局限性。而HemoCue 儀便于攜帶、操作簡單、獲取結果快，適合現場調查時Hb含量的快速測定。因此，本研究首先分析了HemoCue 儀與臨床常用的血液自動分析儀檢測Hb含量的可比性，進一步評估了標本在不同儲存條件與儲存時間下HemoCue儀檢測Hb結果的穩定性，以評價該儀器在現場調查檢測中的適用性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 采集自浙江省某三甲醫院就診人群的EDTA-K2抗凝靜脈血標本100份。為了在較廣的Hb 范圍內比較兩種儀器的可比性，選取標本的Hb值盡量覆蓋低值和高值。

1.2 儀器與試劑 Sysmex 全自動血液分析儀（日本，XE-5000）及配套試劑；HemoCue AB 公司HemoCue儀(瑞典，hb301)，HemoCue 儀微型比色杯。

1.3 方法

1.3.1 兩種檢測儀器的可比性：對Sysmex 全自動血液分析儀進行有效校準，符合質控要求后，對上述的100份血液標本進行Hb含量檢測，同時用HemoCue 儀同步進行測定，比較兩種方法檢測結果的相關性和一致性。Sysmex 儀和HemoCue 儀的操作均嚴格按照儀器說明書進行。HemoCue儀檢測時，取50μl 待測血液充盈微量比色皿的凹槽，然后將微量比色皿放置在檢測槽中，讀取結果。為了減少不同實驗人員操作可能產生的個體間誤差，所有HemoCue 儀的檢測均由同一檢測人員完成。

1.3.2 HemoCue儀的可重復性：采用隨機數字法，從100份標本中隨機選取50份，由同一檢測人員用HemoCue 儀對標本連續重復測量3 次，分析HemoCue 儀測定Hb 的可重復性。

1.3.3 標本儲存條件和時間對HemoCue 儀測定的影響：用隨機數字法，從100份標本中隨機選取45份標本并分成3組，分別在常溫，-4℃與-20℃條件下儲存。為了減少反復凍融對檢測結果的影響，每份標本平均分成4份，分別儲存不同時間（12,24,36和48h）后用HemoCue 儀測定Hb含量，比較不同儲存溫度和時間對檢測結果的影響。

1.4 統計學分析 應用SPSS 21.0 和Medcalc 軟件對數據進行分析和繪圖，兩種檢測方法的相關性用Pearson 相關性分析，一致性比較用Bland-Altman 圖、組內相關系數（interclass correlation coefficient，ICC）和一致性相關系數（concordance correlation coefficient，CCC）指標，重復測量結果的比較和標本儲存條件對檢測結果的影響用重復測量方差分析，結果以均數±標準差（±s）表示。

2 結果

2.1 一般情況 選取調查對象100例，其中男性49例，女性51例，年齡17～88歲，中位年齡41歲。Hb含量63～193 g/L（按Sysmex 儀），中位數134 g/L。其分布如下：60～70 g/L者1例，70～80 g/L 者5例，80～90 g/L 者5例，90～100 g/L 者8例，100～110 g/L者10例，110～120 g/L 者9例，120～130，130～140和140～150 g/L 者各10例，150～160 和160～170 g/L者各9例，170～180 g/L 者13例，＞190 g/L 者1例。

2.2 兩種方法檢測結果的相關性分析 見圖1。Sysmex 儀測定結果為131.47±30.67g/L，HemoCue儀測定結果為139.54±29.83g/L，兩者的差異具有統計學意義（t=11.471,P＜0.001），HemoCue 儀較Sysmex 儀高8.07±3.22 g/L。兩種方法的檢測結果具有較好的相關性（r=0.995，P＜0.000 1），直線回歸分析所得的回歸方程為：Y= 0.967 4X+12.354，r2=0.989，其中Y為HemoCue 儀的檢測值，X為Sysmex 儀的檢測值。

圖1 Sysmex 儀和HemoCue儀檢測Hb 結果的相關性分析

2.3 兩種方法檢測結果的一致性分析 用Bland-Altman 法對兩種方法檢測Hb 結果的一致性進行分析。以兩種方法所得結果的均值為橫坐標，差值為縱坐標繪制散點圖，并標示差值的95%分布范圍，即一致性限度（limit of agreement,LoA，差值均數±1.96×差值標準差），LoA 為（1.8,14.4）。LoA 的95%可信區間為（0.7,15.5)。圖2所示，100個散點有98個散點位于LoA 的95%可信區間內，比例為98%，按＞95%的標準，兩種方法的一致性較好。CCC值為0.960（0.946,0.970），也表明兩種方法的一致性較好。

圖2 Sysmex 儀和HemoCue儀檢測Hb 結果的一致性分析

2.4 靈敏度和特異度 以男性Hb含量少于120g/L，女性Hb含量少于110g/L 為貧血標準，以Sysmex儀為金標準，HemoCue 儀診斷貧血的靈敏度為58.62%，特異度為100%，陽性預測值為100%，陰性預測值為85.54%。

2.5 穩定性 用HemoCue 儀三次重復測量的結果分別為137.55±35.02，137.37±35.26和137.98±34.23 g/L。經單因素重復測量方差分析，三次測量值之間無明顯差異（F=0.975，P=0.381）。不同標本三次重復測量的變異系數范圍為0～3.74%，中位數為1.23%。三次重復測量的組間相關系數ICC 為0.996，95%CI 為（0.993～0.997），說明HemoCue儀測定Hb 的可重復性較好。

表1 標本儲存條件對HemoCue儀檢測Hb值的影響

2.6 標本儲存條件和時間對HemoCue儀檢測Hb結果的影響 見表1。在不同溫度下儲存不同時間后，血樣中的Hb含量均受到了不同程度的影響。常溫下，從0～48 h，Hb值略有升高趨勢，重復測量方差分析發現差異有統計學意義（F=9.863，P=0.000 1）。），主要表現為儲存24，36和48 h 后，Hb含量高于0h 時。-20℃組的Hb值變化與常溫組類似，36和48 h 的Hb值顯著高于0h。4℃組的Hb 與常溫和-20℃組相比，相對穩定，僅48h 與24h 有差異。

3 討論

Hb含量是反映機體健康的常規指標之一，多種疾病對機體的影響表現為Hb 的變化。Hb 的檢測方法較多，檢測技術也較為成熟。但在實驗室、醫療機構和現場調查中，對儀器和方法的需求有所差別，如在現場人群調查中，通常需要方便攜帶、操作簡單、結果判讀迅速的快速分析儀，同時又要求其測定結果有較高的精確度和準確度，且與專業領域內公認的方法有良好的可比性。HemoCue 儀機型小巧，所需血液量少，操作簡便，結果讀取快速，符合現場調查所需的要求，也是當前現場應用較多的便攜式Hb 檢測儀之一。本文對HemoCue 儀進行評價，通過與臨床廣泛使用的血細胞分析儀進行比較，分析其Hb 測定的一致性、可重復性，同時也分析了標本在不同儲存條件下對Hb檢測值的影響，為現場應用提供參考。

本研究結果顯示HemoCue儀檢測人體內Hb含量比Sysmex 儀略高，但兩者統計學分析仍有較好的線性相關性，國內外也有多篇文獻均報道HemoCue 儀測定的Hb值高于Sysmex 儀[6-10]，與本研究結果一致，兩者的差異有些文獻報道存在統計學意義而有些無統計學意義。該結果也提示在采用HemoCue 儀診斷貧血時，其Hb含量可能會被高估。HemoCue 儀的靈敏度為58.62%，特異度100%，有報道稱HemoCue 儀診斷貧血的靈敏度為68.7%～70%，特異度為70%～85.8%[7,9]，均不甚理想，可見當用HemoCue 儀進行貧血診斷時應注意采用“金標準”或公認的方法進行校正。

目前對HemoCue 儀能否替代Sysmex 儀尚沒有一致的結論[11]，部分研究認為兩者的一致性較好，Spielmann 通過對256份標本的分析顯示，只有0.8%未達到臨床所需的界限[12]，而FRASCA 等[13]則發現有31%標本的差值超過了20g/L。從本研究結果來看，盡管統計學分析顯示兩者的相關性和一致性均較好，按照臨床可接受的界限，HemoCue 儀尚不能完全替代Sysmex 儀。導致兩種儀器測定結果差異的因素很多，首先，兩種檢測方法的原理不同，前者為HiN3 法，是利用去氧膽酸鈉釋放紅細胞中的Hb，亞硝酸將Hb 轉化成高鐵血紅蛋白，高鐵血紅蛋白再與疊氮化鈉結合生成疊氮高鐵血紅蛋白，然后比色測定；后者為SLS 法，是利用表面活性劑溶解紅細胞，釋放Hb，將Hb 中的二價鐵氧化成三價鐵并與SLS 結合形成有色基團，再比色測定。其次，兩者的校準檢測體系也有可能有一定的系統誤差[14]。再者，兩方法的原理、機制不同，環境溫度、濕度以及病理條件等都可能對檢測結果有不同程度的影響[15]。

此外，本研究發現標本的儲存溫度和儲存時間對Hb值均有不同程度的影響。與新采集的標本相比，常溫和-20℃儲存對標本的影響比4℃更顯著，而且儲存時間延長對Hb值的影響明顯。因此，采用HemoCue 儀進行Hb含量測定時，在標本采集后應盡早檢測，若在現場條件限制無法及時檢測時，可首選在4℃儲存待測。WHITEHEAD 等[15-16]研究也發現在長時間、高于室溫的條件下保存標本后，HemoCue 儀測定的Hb含量比新采集的標本有所升高，而在室溫或冷藏條件下保存24 h 內影響較小。本研究結果進一步證實，在室溫條件下標本儲存時間應控制在12 h 內，否則會使測定結果偏高。

通常對兩種不同方法進行一致性比較和評價時需同時考察集中趨勢、離散趨勢和相關性，常用指標有ICC，CCC，Bland-Altman 圖和Kappa系數等[17-20]。CCC 除了能反映出兩者的相關性外，還能體現差異大小，對一致性的評價更為全面；ICC 是在假定總變異（即個體間變異與個體內變異之和）一定的情況下，個體間的變異占總變異的比例，即個體間變異越大，ICC值越高，一致性也越好，一般認為＞0.75 一致性良好[21]，本研究顯示由同一檢測人員重復測量3 次的ICC值為0.996，說明從統計學的角度，HemoCue儀重復測定的穩定性較好，現場應用時無需多次測量。Bland-Altman 圖也是近幾年應用相對較多的方法，其優點在于通過圖的展示比較直觀，缺點在于LoA的95%CI計算尚未統一，且其反映的是統計學上的一致性，在現場與實際工作中仍需顯示結果的實際情況[20-22]。本研究中盡管按LoA的95%可信區間判定，98%標本一致性良好，仍有44%標本一致性欠佳。

綜上所述，與Sysmex 儀相比，HemoCue 儀在檢測Hb含量有較好的一致性和穩定性，鑒于其便攜性、操作簡便和所需血量少等優點，適用于瘧疾等疾病的現場調查，但用其進行貧血診斷時，需應用“金標準”或公認的方法進行校正。本研究還存在一定的局限性：一是標本量相對較少，待測樣本Hb值范圍有待進一步擴大，尤其是高值范圍內Hb，這樣才能更全面地比較兩種方法的可比性；二是本研究采用的標本是抗凝靜脈血，但HemoCue儀在現場人群檢測時一般采集的是手指血，兩種不同血樣其檢測結果是否一致也仍需進一步比較。