Sestrin3在子宮內膜樣腺癌中的表達及其臨床意義

高佩璐 劉 鈞

川北醫學院，四川省南充市 637100

子宮內膜癌(Endometrial carcinoma,EC)是一類發生于子宮內膜上皮的惡性腫瘤，是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一，而子宮內膜樣腺癌(Endometrioid adenocarcinoma,EA)是子宮內膜癌中最常見的組織學類型。盡管大多數子宮內膜癌患者確診時都在早期，具有良好的預后，但晚期或者發生轉移的子宮內膜癌患者預后往往較差、生存率較低[1]。預后不良可能與子宮內膜癌的進展有關，進一步探索子宮內膜癌發生發展過程中的具體機制，對于子宮內膜癌患者的診治及預后具有重要意義。

Sestrins是一類高度保守的應激誘導蛋白家族，包括Sestrin1、Sestrin2和Sestrin3。其中，Sestrin1、Sestrin2的表達受P53調控，而Sestrin3的表達受叉頭盒O轉錄因子(Forkhead box O transcription factor)調控。研究表明，Sestrins在衰老、代謝穩態、脂質積聚和胰島素抵抗等方面發揮了重要作用[2]。近年來，大量證據表明其與惡性腫瘤性疾病的發生發展也有一定關系。目前研究發現，Sestrin3通過不同機制在食管鱗癌、肝癌、肺癌的進展中發揮了一定作用[3-5]，但尚缺乏Sestrin3在子宮內膜癌中的研究報道。本研究應用免疫組織化學方法對子宮內膜樣腺癌組織及其前期病變子宮內膜增生不伴非典型性(Endometrial hyperplasia without atypia,EH)/子宮內膜增生伴非典型性(Atypical endometrial hyperplasia,AEH)組織，和增殖期子宮內膜(Proliferative phase of endometrium,PE)組織中Sestrin3的表達情況進行檢測，并分析子宮內膜樣腺癌組織中Sestrin3的表達與臨床病理特征及預后的關系，以對Sestrin3在子宮內膜樣腺癌發生發展過程中的作用作一初步探討。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取2010年4月—2015年4月期間于川北醫學院附屬醫院經病理確診的93例子宮內膜樣腺癌患者組織標本及臨床資料，同時選取同期增殖期子宮內膜組織標本30例及子宮內膜增生不伴非典型性、子宮內膜增生伴非典型性組織標本各40例作為對照組。納入標準：(1)有完整臨床資料；(2)子宮內膜樣腺癌病例均為原發，術前均未經放化療或激素治療；(3)增殖期子宮內膜組織來源于因子宮肌瘤切除子宮的患者。排除標準：(1)合并其他部位惡性腫瘤；(2)正在參與其他研究。子宮內膜樣腺癌患者共93例，年齡35～79歲，中位年齡55歲，其中≤50歲28例，>50歲65例；根據2014版世界衛生組織(World health organization,WHO)分級標準，組織學分級1級64例，2級21例，3級8例；國際婦產科聯盟(International federation of gynecology and obstetrics,FIGO)分期Ⅰ期81例，Ⅱ期8例，Ⅲ期4例；浸潤深度≤1/2肌層80例，>1/2肌層13例；其中63例進行淋巴結清掃手術，術后證實有淋巴結轉移3例，無淋巴結轉移60例。本研究經醫院倫理委員會審批通過，所有患者均對本研究知情并簽署知情同意書。

1.2 免疫組織化學染色方法 將石蠟包埋的組織標本進行連續切片(厚度約4μm)，使用環保透明劑脫蠟，梯度乙醇脫水，使用高壓鍋法用檸檬酸組織抗原修復液進行抗原修復，依次滴加3%過氧化氫(封閉內源性過氧化物酶)、山羊血清(封閉組織內非特異性抗原)。之后加入適量Sestrin3抗體(克隆號：P58005，1∶40，成都正能生物公司)，4℃冰箱內孵育過夜。第2天滴加相應種屬二抗，DAB顯色劑顯色，蘇木素復染，返藍，脫水，透明，中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。以試劑盒提供的陽性標本作為陽性對照，以PBS替代一抗作為陰性對照。

1.3 免疫組織化學染色方法結果判讀 病理結果由本院兩名資深病理科主任醫師分別閱片完成，Sestrin3蛋白陽性表達主要位于細胞質及部分細胞核中，呈棕褐色或棕黃色顆粒。依據染色強度評分：0分：不著色，1分：黃色，2分：棕黃色，3分：黃褐色；依據陽性細胞比例評分：0分：無細胞染色，1分：<25%，2分：25%～50%，3分：50%～75%，4分：≥75%。將上述兩項評分相乘，0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，>5分為強陽性。

1.4 隨訪方法 通過門診或住院就診、電話、微信等方式對所有患者進行隨訪，將因子宮內膜樣腺癌死亡定義為結局變量，其他因素死亡均作為截尾數據處理，隨訪截止時間為2020年4月，記錄患者的預后情況。

1.5 統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行統計學分析，計數資料組間比較采用χ2檢驗；采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較采用Log-rank檢驗。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 Sestrin3在不同子宮內膜組織中的表達情況 Sestrin3蛋白主要表達于細胞質和部分細胞核，陽性顆粒為棕褐色或棕黃色(圖1)。本實驗中Sestrin3在增殖期子宮內膜、子宮內膜增生不伴非典型性、子宮內膜增生伴非典型性、子宮內膜樣腺癌組織中的表達陽性率分別為93.33%、87.50%、62.50%、39.78%。各組間Sestrin3的表達不完全相同，且Sestrin3在子宮內膜增生伴非典型性和子宮內膜樣腺癌組織中表達的陽性率明顯低于增殖期子宮內膜、子宮內膜增生不伴非典型性組織(表1)。

表1 Sestrin3在不同子宮內膜組織中的表達情況

2.2 子宮內膜樣腺癌中Sestrin3的表達與臨床病理特征的關系 如表2所示，子宮內膜樣腺癌中Sestrin3的表達與組織學分級相關(P<0.05)，與年齡、肌層浸潤深度、淋巴結轉移、FIGO分期無相關性(P>0.05)。

表2 Sestrin3表達與子宮內膜樣腺癌患者臨床病理特征之間的關系

2.3 Sestrin3表達情況與子宮內膜樣腺癌患者生存情況的關系 93例子宮內膜癌患者中，共62例患者獲得完整隨訪資料，共5例患者因子宮內膜樣腺癌死亡，其中1例為Sestrin3陽性，4例為Sestrin3陰性。Kaplan-Meier生存分析表明，Sestrin3的表達情況與子宮內膜癌患者的生存期無相關性(P>0.05)。見圖2。

圖2 Sestrin3陽性與陰性患者的總生存曲線Sestrin3陽性18例，陰性44例

3 討論

Sestrin是一種在應激狀態下產生的高度保守的蛋白家族，受P53和FoxO調控。Sestrin可通過抑制雷帕霉素作用靶點復合物1[mechanistic target of rapamycin(mTOR) complex 1，mTORC1]活性、減少活性氧(Reactive oxygen species,ROS)積累、刺激自噬，在多種疾病過程中發揮重要作用[6-7]。

本研究檢測了Sestrin3在增殖期子宮內膜、子宮內膜增生不伴非典型性、子宮內膜增生伴非典型性、子宮內膜樣腺癌組織中的表達，免疫組織化學法顯示Sestrin3的陽性表達率依次降低，符合子宮內膜樣腺癌的進展過程，提示Sestrin3的表達下調可能與子宮內膜樣腺癌的發生發展相關。Sestrin3作為Sestrin家族的一員，目前在惡性腫瘤中的研究比較缺乏，但已有研究表明，Sestrin3在多種腫瘤發生發展中起著重要作用。敲除Sestrin3基因的小鼠更容易被誘發肝細胞肝癌[4]。在非小細胞肺癌中，胡蘿卜素B可通過Sestrin3調控腫瘤細胞的增殖與凋亡[5]。然而在與臨床病理特征相關性分析時，發現Sestrin3的表達僅與組織學分級有關，而年齡、肌層浸潤深度、淋巴結轉移與否、FIGO分期與生存時間關系不顯著。雖然生存分析結果顯示Sestrin3的表達與子宮內膜樣腺癌患者的生存時間關系不顯著，但數據表明Sestrin3陰性表達患者中死亡病例共4例，多于Sestrin3陽性表達病例。且Sestrin3陰性死亡病例的生存時間分別為3、7、8、48個月，短于Sestrin3陽性死亡病例。若擴大隨訪數據、延長隨訪時間可能會得到不同結果。

mTORC1信號通路在許多腫瘤中都被激活，該通路可通過增加蛋白質、脂質的生物合成和增加能量的產生以促進腫瘤表型。研究表明，mTORC1在子宮內膜樣腺癌細胞株中的活性水平明顯升高，并促進腫瘤細胞的生長和增殖。且mTOR抑制劑可逆轉子宮內膜樣腺癌細胞的增殖、遷移和上皮—間質轉化(EMT)標志物的表達[8-9]。自噬可作為腫瘤發生的抑制因素，抑制自噬可導致蛋白降解減少、合成代謝增加，從而促進癌細胞的增殖[10]。而在子宮內膜樣腺癌中發現存在自噬基因的頻繁突變，提示其自噬作用受到損害[11]。已有研究證實Sestrin3的表達可抑制mTORC1信號傳導并刺激自噬。

綜上所述，Sestrin3在子宮內膜樣腺癌發生發展過程中表達逐漸降低，提示Sestrin3可能在子宮內膜樣腺癌的發生、發展中發揮抑癌基因的作用，并且可能通過抑制mTORC1和刺激自噬而發揮作用，但這一推測需進一步實驗驗證。此外，Sestrin3調控mTORC1和自噬的具體機制還有待進一步研究。