益氣活血顆粒治療慢性心力衰竭的網絡藥理學探究

張燕飛，陳蘇寧

心力衰竭是心血管疾病的最后階段，已對全球公共衛生構成巨大威脅[1-2]。盡管過去幾十年在治療方面取得了進展，但心力衰竭的患病率仍在繼續增加[3-4]。心力衰竭具有極其復雜的病理生理機制，目前指南中推薦的藥物如血管緊張素轉換酶抑制劑、β受體阻滯劑和螺內酯，往往直接針對有限的分子和途徑，這些藥物的聯合使用往往是為了達到更好的效果，但同時也會造成較高的醫療負擔和副作用，增加病人的經濟負擔[5-6]。因此，探討潛在的治療心力衰竭策略是非常必要的。

中醫方劑為慢性心力衰竭提供了多種治療選擇，益氣活血顆粒(Yiqihuoxue granules，YHG)由中醫經典方劑(Ling Gui Zhu Gan Decotion，LGZGD)加減而來，陳蘇寧教授治療慢性心力衰竭(CHF)有多年臨床經驗，在苓桂術甘湯經典方之上加黃芪、丹參、赤芍三味中藥，均取得良好療效。現代研究也證明，丹參、黃芪、赤芍均具有保護心臟的作用。丹參注射液可預防心肌纖維化、心肌肥厚、血流動力學惡化以及收縮期和心臟功能衰竭的舒張功能障礙[7]。黃芪注射液作為臨床上廣泛應用的專利藥物，具有增強心肌收縮力、改善循環、保護心肌細胞、調節免疫等作用。此外，黃芪注射液中發現的活性成分對缺血缺氧心肌細胞也具有保護作用[8]。黃芪口服液有助于改善慢性心力衰竭心肌纖維化病人的心功能和血管炎癥[9]。從赤芍中提取的赤芍總苷經現代藥理研究證實其具有抗凝血、抗血栓、改善微循環、保護心臟缺血等藥理作用[10]。

1 資料與方法

1.1 資料 中藥系統藥理學數據庫及分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform， TCMSP.http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php， Version： 2.3)；蛋白序列數據庫UniProtkb(https：//www.uniprot.org/)；蛋白序列數據庫DisGeNET(https：//www.disgenet.org/)；蛋白質相互作用網絡(STRING Database，https：//string-db.org/，Version：11.0)；作圖軟件Cytoscape Software，version 3.7.1；基因功能富集分析平臺(DAVID 6.8 https：//david.ncifcrf.gov/、CTD，http：//ctdbase.org/)；韋恩圖(venny 2.1，https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)；網絡分析軟件Network Analyzer(Clue GO，Clue Pedia)。

1.2 方法

1.2.1 收集潛在的活性成分并預測其目標 口服生物利用度(OB)和藥物相似度(DL)是藥物研發中評價藥物活性成分的兩個重要參數，分別反映了藥物在人體中的吸收和分布，這些成分可與現有藥物的相似性以及預證明開發藥物的可能性。因此，在OB>30%和DL>0.18的條件下，從TCMSP中篩選出益氣活血顆粒的有效活性成分及其對應的靶標(TCMSP數據庫中的靶標數據來源于DrugBank數據庫)[11]，將獲得的目標物輸入到UniProt數據庫中，利用UniProt知識庫(UniProtkb)將蛋白名轉化為基因名。

1.2.2 篩選作用靶標 在DisGeNET數據庫中，進入首頁，點擊search，選擇disease，輸入疾病名“CHF”并點擊搜索，取得與該疾病相關的“基因”。將藥物靶點和疾病靶點輸入Venny 2.1，取交集，獲取藥物-疾病交集靶點，上述靶點被認為是益氣活血顆粒治療慢性心力衰竭的作用靶點，然后將交集靶點的“基因名”輸入STRING Database數據庫，利用其“Multiple proteins search”工具，將得到的蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)關系，以tsv格式保存為文件。

1.2.3 構建“藥物-成分-作用靶點”網絡和PPI網絡 將作用靶點及其對應的活性成分及其相關藥材輸入到Cytoscape軟件中，構建“藥物-成分-靶點”網絡。另外，將上述tsv格式文件中“node1”“node2”“combinescore”欄信息加載到Cytoscape軟件中，得到初始PPI網絡。利用工具網絡分析儀對其進行分析，主要關注其統計結果之一的節點自由度(Degree)，根據Degree編輯最終的網絡并將其導出到圖像中。

1.2.4 進行基因本體(GO)功能與京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路分析 利用DAVID 6.8數據庫來豐富GO功能，包括分子功能(MF)、生物過程(BP)和細胞成分(CC)，也可用該數據庫研究KEGG通路；用Clue Pedia編輯網絡，使其能夠顯示作用靶點和途徑之間的聯系；同時，根據需要手動篩選節點。

2 結 果

2.1 益氣活血顆粒的潛在活性成分及其相關靶點 在TCMSP中分別輸入茯苓、桂枝、白術、炙甘草、丹參、黃芪、赤芍7味中藥，在OB>30%和DL>0.18的條件下，篩選出223種有效成分，包括丹參酮ⅡA、山柰酚、槲皮苷、十八烯酸、柚苷配基、谷固醇、糖甙、甘草素C、鱗葉甘草素A、7-鄰甲基異亮醇、常春藤皂苷元、7-甲氧基-2-甲基異黃酮、黃芩素、二氫丹參內酯等3 429個靶點，其中茯苓15種、桂枝7種、白術7種、甘草92種(炙甘草/甘草)、丹參53種、黃芪20種、赤芍29種，剔除重復目標后，共有321個靶點。詳見表1。

表1 益氣活血顆粒有效活性成分數量 單位：個

在UniProt數據庫中，使用搜索引擎“UniProtKB”，經過“reviewed (Swiss-Prot)”和“Human”過濾，輸入獲得的321個靶點并逐一檢查，最終，只有297個靶點名稱被成功轉化，這些靶點均與慢性心力衰竭相關，都是通過在CTD中查找與該疾病相關的“基因”而被命名為作用靶點。

2.2 構建網絡 有297個預測靶標和慢性心力衰竭有關，包括TNF、MAPK1、IL-6、BCL-2、JUN、RELA、STAT3、MMP、TP53、Caspase等，將297個作用靶點輸入STRING Database數據庫，將organism設置為“Homo sapiens”，點擊“SEARCH”，構建初始PPI網絡。

將297個作用靶點對應的活性成分及其相關藥材導入Cytoscape軟件，構建藥物-成分-靶點網絡(見圖1)，將297個化合物靶點(297個化合物靶點輸入Venny 2.1軟件，只有292個靶點被顯示)與73個慢性心力衰竭靶點基因取交集，得到16個交集基因(見圖2)。并將初始PPI網絡及其combined scores導入Cytoscape軟件。根據16個交集靶點的Degree構建最終的PPI網絡(見圖3)。

圖1 益氣活血顆粒的“藥物-成分-作用靶點”網絡(藍色為茯苓；紫紅色為桂枝；紅色為白術；綠色為甘草；黃色為丹參；橙色為黃芪；深藍色為赤芍)

圖2 慢性心力衰竭靶點基因交集(List 1為慢性心力衰竭靶點；List 2為益氣活血顆粒有效活性成分靶點)

圖3 藥物成分-疾病交集基因網絡圖(以Degree為準，顏色越深意義越大)

2.3 分析網絡 益氣活血顆粒的藥物-成分-作用靶點網絡圖1中，淺藍色尖角形節點代表茯苓活性成分，紫色菱形節點代表桂枝活性成分，紅色平行四邊形節點代表白術活性成分，綠色三角形節點代表甘草活性成分，黃色多邊圓形節點代表丹參活性成分，橙色六邊形節點代表黃芪活性成分，深藍色正方形節點代表赤芍活性成分。共包含407個節點和3 037條邊。天藍色橢圓節點表示297個作用靶點，邊表示活性成分與作用靶點之間的關系。

2.4 GO功能和KEGG通路富集分析

2.4.1 GO功能富集分析 應用DAVID 6.8豐富苓桂術甘加減湯的297個藥物作用靶點的GO功能，選擇“Homo sapiens”，共有285個基因被識別，點擊DISEASE選項，顯示10個與之相關的疾病，包括心肌梗死、酒精依賴、高血壓、癡呆、充血性心力衰竭、動脈粥樣硬化、瘧疾、乳腺癌等。詳見圖4。

GO分析結果分別為GO-BP生物學過程、GO-CC細胞組分和GO-MF分子功能。GO-BP富集含有135條， 它們參與調節細胞的增殖、生長和凋亡；基因轉錄與表達；蛋白質合成、活化和分解；能量使用；交感神經和副交感神經傳輸的調節具有抗氧化保護、調節免疫系統、血管生成、內皮細胞增生作用。GO-CC富集含有7條，包括細胞外空間、細胞外區域、質膜外側面、胞質的核周區、早幼粒細胞白血病體、核周體、受體復合體。GO-MF富集含有13條，包括細胞因子活性、蛋白質異源二聚體活動酶結合、蛋白質同源二聚化活動、相同的蛋白結合、去甲腎上腺素結合、腎上腺素結合、蛋白結合、核心啟動子序列特異性DNA結合、蛋白磷酸酶綁定、p53綁定、蛋白酶綁定、Ras鳥苷核苷酸交換因子活性。按照P值取前5條，并作圖統計。詳見圖5。

圖5 GO分析過程

2.4.2 KEGG通路富集分析 將16個交集靶點輸入David 6.8，得到KEGG通路共33條，與炎癥相關的通路主要有TNF信號通路和HIF-1信號通路；與神經體液有關的因素主要有細胞因子受體相互作用和鈣信號通路。此外，在ClueGO中輸入16個交集靶點來豐富GO函數(僅BP，使用GO Term Fusion，P≤0)。KEGG通路的富集顯示了每個通路中作用靶點的位置，潛在的活性成分通過影響這些靶點的表達或功能來影響通路的整體功能。詳見圖6。

圖6 KEGG通路富集分析圖

2.4.3 基于心力衰竭發病機制分析 益氣活血顆粒加減方的分子機制，益氣活血顆粒加減方藥物-成分-作用靶點網絡體現了中醫藥治療慢性心力衰竭多成分(潛在有效成分)和多靶點的特點(見圖1)，GO功能的豐富反映了作用靶點自身及其在人體多個部位連接的重要功能，包括細胞及其生存環境(見圖5)。

有研究表明，炎癥系統的過度激活和炎癥細胞因子的過度釋放加速了慢性心力衰竭的病理生理過程，導致心室重構和負性肌力作用[12]。白細胞介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在慢性心力衰竭病人中活躍，導致左心室容積和壓力增加，心功能受損，加重慢性心力衰竭[13]，慢性心力衰竭病人在很長一段時間內處于相對缺血狀態，導致IL-6和TNF-α的過度生成和分泌，惡化心臟收縮性。

沉寂信息調節因子(silent information regulator 1， Sirt1)是調控細胞壽命的關鍵基因， 在許多方面具有心臟保護作用，它參與基因沉默、細胞衰老、細胞分化和細胞存活[14]，提示Sirt1可能在衰老過程中發揮重要作用，并與心肌細胞的死亡和生存有關。體外研究發現，內源性Sirt1在介導心肌細胞存活中發揮了重要作用：Sirt1的過表達對心肌細胞凋亡具有保護作用，而Sirt1的下調可能與凋亡細胞有關[15]。在體心臟模型、離體Langendorff模型或體外培養的心肌細胞均有研究表明，Sirt1通過調節凋亡抑制、延緩衰老、減輕氧化應激等作用，對心血管應激具有保護作用[16]。

內皮素-1被認為是許多疾病的致病標記，已知在冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、糖尿病和高血壓以及心力衰竭發生發展中發揮重要作用[17]，循環中的內皮素-1水平在心力衰竭時升高，預測預后不良[18]。內皮素-1對心臟組織有多種生物學作用，內皮素通過冠狀血管收縮影響心臟功能，內源性內皮素-1可能參與多種心血管疾病的進展，內皮素拮抗劑目前臨床上用于治療肺動脈高壓病人，被認為有進一步的靶疾病如心力衰竭、心肌肥厚等心臟疾病、腎臟疾病、全身性高血壓、腦血管痙攣等[19]。

基質金屬蛋白酶(MMPs)在心力衰竭的發病機制中起重要作用，心肌細胞外基質(ECM)是心臟結構和生理穩態的基礎動態環境，ECM穩態的改變可能導致舒張或收縮功能障礙，從而導致心力衰竭，對于ECM的降解，MMPs起作用。與心力衰竭相關的最常分析的MMPs為MMP-2和MMP-9，其循環水平可以作為心力衰竭病人治療效果的指標，也可以作為通過改變MMPs通路來確定哪些病人可以從特定的治療干預中獲益[20]。

RNA測序結果顯示，經氧化還原處理的小鼠心臟中血紅素氧合酶-1 (Hmox1)顯著上調。可誘導的血紅素氧合酶1在氧化還原酶誘導的心臟損傷中被Nrf2的核轉位上調，催化血紅素降解，促進游離鐵的釋放，導致鐵中毒，最終導致心力衰竭[21]。

3 討 論

心力衰竭是一種復雜的臨床綜合征，以心功能受損和/或結構異常引起的心輸出量減少和/或心內充盈壓力升高為典型體征和癥狀，也是一個主要的公共衛生問題，在美國每年大約有91.5萬人新發心力衰竭病例被診斷，不論男女，心力衰竭的發病率均隨年齡增長而增加[22-23]。有研究表明，苓桂術甘湯對慢性心力衰竭治療有效，薛經緯等[24]通過觀察136例心力衰竭病人顯示，參附湯合苓桂術甘湯能降低慢性心力衰竭病人腦鈉肽水平，提高心功能，臨床治療效果較佳，在慢性心力衰竭臨床治療上有益。楊建華等[25]治療72例心力衰竭病人，發現桂枝赤芍方能改善心力衰竭病人血流動力學，較西藥常規治療有效，并且能提高病人的生活質量。丹參酮能抑制心肌氧化應激水平，改善心力衰竭大鼠心肌纖維化水平[26]。中西醫結合治療益氣活血利尿是治療心力衰竭的有效方法。

網絡藥理學是以系統生物學為基礎，結合多向藥理學，通過構建多個網絡，闡述藥物、分子、靶點、疾病和通路之間的關系，從更全面的角度解釋中藥處方的分子機制，這也與中醫學治療疾病的整體觀是一致的。因此，本研究應用網絡藥理學對益氣活血顆粒治療慢性心力衰竭的分子機制進行初步探索，為其深入研究、進一步開發應用提供思路。

中藥方劑具有臨床療效，但其改變人體病理狀態的分子機制尚未揭示。通過網絡藥理學可以直觀地看到益氣活血顆粒對機體分子的綜合影響，根據當前對慢性心力衰竭發病機制的研究和疾病分子變化進程分析，進一步探討益氣活血顆粒對細胞的影響及其環境，提供一個初步的分子機制探索治療慢性心力衰竭的處方。

本研究顯示，益氣活血顆粒可能通過IL-6、TNF、HMOX1、EDN1、MMP2等關鍵靶點影響慢性心力衰竭的治療過程。本研究在預測297個目標的基礎上，通過16個疾病-藥物交集基因，得到了它們之間的相互作用、GO功能和KEGG通路富集；并進一步分析和推斷益氣活血顆粒的分子機制，為后續醫學實驗證明該分子機制提供思路與指導，將在以后的實驗中加以驗證。