二仙湯治療高血壓的網絡藥理學研究

朱 穎，李丹丹，吉 潔，梅 俊，徐鳳芹

我國高血壓患病率逐年上升，但仍未得到很好的控制。最近一次調查結果顯示我國35～75歲的成年人中近一半患有高血壓，其中只有不到三分之一的病人正在接受治療[1]，成年高血壓病人中有超過2.6億的病人血壓未得到有效控制[2]。

中醫中藥在高血壓治療方面具有多效性、多靶點、前瞻性、穩定性等優點，中藥具有協同降壓、改善癥狀、改善情緒、改善代謝、提高生活質量、增效減毒、靶器官保護、減/撤西藥等作用[3-4]。二仙湯是20世紀中葉上海中醫藥大學張伯訥教授的經驗方，主要用于治療婦女絕經前后諸病[5]。方中仙茅、淫羊藿為君藥，巴戟天為臣藥，佐以黃柏、知母，以當歸為使，此方溫補與瀉熱合用，壯陽與滋陰并施，旨在溫補腎精、調理陰陽。有研究表明，二仙湯對于更年期高血壓有較好的療效[6]。但目前尚未見二仙湯治療高血壓的藥效物質基礎及分子生物機制研究。

近年來，網絡藥理學廣泛應用于中醫藥的研究中，其基于系統生物學，通過與生物信息學等學科相結合，從多成分、多靶點、多通路角度闡明中藥方劑治療復雜疾病的潛在分子機制[7]。故本研究旨在用網絡藥理學的方法分析二仙湯治療高血壓的潛在靶點，并初步探討其作用機制，為下一步實驗提供支持與思路。

1 資料與方法

1.1 二仙湯活性化合物的篩選 口服生物利用度(OB)是客觀評價藥物質量的一個重要指標，一般口服生物利用度值越高，在臨床應用的可能性越大[8]。藥物相似度(DL)是指化合物與已知藥物的相似性，具有類藥性的化合物不一定是藥物，但具有成為藥物的可能性[9]。這兩個指標常被用作化合物活性篩選，故在中藥系統藥理學數據庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)數據庫(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)以OB≥30%、DL≥0.18的條件下[10]，分別篩選淫羊藿、仙茅、巴戟天、黃柏、知母、當歸6味中藥的化學成分作為候選藥效成分。

1.2 二仙湯潛在靶點預測及成分靶點網絡構建 在TCMSP數據庫中進一步檢索候選藥效成分得到潛在靶點，在Uniprot數據庫中替換為標準基因名，以Excel形式保存為Data文件和表型文件，通過Cytoscape 3.6.1軟件構建二仙湯成分-靶點網絡圖。

1.3 高血壓疾病靶點預測 以“hypertension”為關鍵詞，分別檢索TTD、基因功能富集分析平臺(CTD)、Drugbank數據庫得到高血壓靶點信息，在Uniprot數據庫進行蛋白基因名轉換。

1.4 網絡相互作用與分析 分別將二仙湯成分靶點和高血壓疾病靶點數據導入在線蛋白質互作(STRING)數據庫(https：//string-db.org/version 11.0)，將物種(organism)設置為“Homo sapiens”，分析獲得蛋白質-蛋白質相互作用圖(PPI)。并將互作圖中信息保存為tsv格式導入Cytoscape 3.6.1軟件，構建疾病靶點網絡圖。用Cytoscape 3.6.1軟件的混合(merge)功能將兩個網絡圖合并，得到二仙湯-高血壓共同靶點圖。按照Betweeness和節點自由度(Degree)同時大于均值的標準篩出關鍵靶點[11]。

1.5 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集可視化分析 將網絡互作得到的藥物-疾病共同靶點基因導入David數據庫，進行注釋及KEGG通路富集分析，并利用R3.6.3分別以柱形圖和高級氣泡圖進行可視化。

2 結 果

2.1 篩選預測結果 根據OB≥30%、DL≥0.18條件，淫羊藿篩選后納入23種成分，仙茅篩選后納入7種成分，知母篩選后納入15種成分，黃柏篩選后納入37種成分，巴戟天篩選后納入20種成分，當歸篩選后納入2種成分，共篩選得到91種藥效成分，去除未查到靶點的成分，共得到78種候選藥效成分，列出Degree值排名前10位的成分信息(見表1)以及144個潛在靶點。以“hypertension”為檢索詞，TTD數據庫共檢索到高血壓靶點17個，CTD數據庫共檢索到高血壓靶點222個，Drugbank數據庫共檢索到高血壓靶點170個，合并去重后共得到高血壓相關靶點基因333個。

表1 二仙湯部分候選藥效成分信息

2.2 網絡構建結果

2.2.1 二仙湯成分-靶點網絡構建 將二仙湯成分靶點Excel表導入Cytoscape 3.6.1軟件中，得到二仙湯成分-靶點網絡圖(見圖1)，該網絡共包含節點222個，邊1 498條，其中78個節點代表藥效成分，144個節點代表藥效成分相關潛在靶點。應用Cytoscape軟件“network analyze”功能對網絡進行分析，網絡平均Degree數為13.50，然而在網絡中部分節點比其他節點更集中，在網絡圖中有很多成分與多個靶點相連接，槲皮素如(quercetin，Degree=80)、山柰酚(kaempferol，Degree=52)，這也印證了中藥多成分、多靶點的作用特點。根據 Degree值降序排列，排名居前的成分有槲皮素、山柰酚、β-谷甾醇、去水淫羊藿素等，這些可能是主要藥效成分。同樣，網絡圖中也有同一靶點來自多個活性成分，如雌激素受體1(ESR1，Degree=64)、雄激素受體(AR，Degree=62)、前列腺素內源性過氧化物合酶1(PTGS2，Degree=52)。

圖1 二仙湯成分-靶點網絡圖

2.2.2 PPI網絡構建 分別將二仙湯潛在靶點和高血壓疾病靶點導入STRING數據庫，得到各自蛋白互作圖，保存高血壓靶點蛋白互作圖(見圖2)。將兩個互作信息分別導入Cytoscape 3.6.1軟件得到相應網絡圖，Merge兩個網絡圖得到二仙湯-高血壓共同靶點圖(見圖3)，該網絡包含53個節點、336條邊，其中53個節點代表二仙湯和高血壓的共同靶點基因，這些可能是二仙湯治療高血壓的潛在靶點，根據Degree和Betweeness Centrality同時大于均數的標準篩選得到6個關鍵基因，分別為雄激素受體(AR，Degree=62)、前列腺素內源性過氧化物合酶1(PTGS2，Degree=52)、活化型一氧化氮合酶(eNOS，Degree=22)、腫瘤壞死因子(TNF，Degree=6)、轉錄因子AP-1(JUN，Degree=6)、細胞腫瘤抗原P53(TP53，Degree=5)。網絡圖根據Betweeness Centrality值漸變設置填充顏色和節點及標簽字體大小，關鍵基因表現為三角形節點，橢圓形節點為其他共同靶點基因。

圖2 高血壓靶點蛋白互作圖

圖3 二仙湯-高血壓共同靶點圖

2.3 KEGG通路富集分析結果 將53個共同靶點基因導入David數據庫，得到57條KEGG通路，根據P值升序排列，選取前15條通路，利用R3.6.3將通路作成氣泡圖可視化，縱坐標代表通路，橫坐標代表P值大小，圓點越靠近縱軸，P值越小，即基因在這條通路上顯著性越高，圓點的大小代表基因數，圓點越大則該條通路上基因數越多。詳見圖4。可以看出，53個共同靶點顯著富集于多條與高血壓相關的通路上，如神經活性配體-受體相互作用(neuroactive ligand-receptor interaction)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、環鳥苷酸-蛋白激酶G信號通路(cGMP-PKG signaling pathway)、癌癥通路(pathways in cancer)等。

圖4 KEGG通路富集分析氣泡圖

2.4 GO富集分析結果 將53個共同靶點基因導入David數據庫，保存MF、CC、BP的信息，根據基因數占比排序，利用R3.6.3制成柱形圖。詳見圖5。可以看出二仙湯治療高血壓可能與信號轉導(signal transduction)、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、對藥物的反應(response to drug)、對缺氧的反應(response to hypoxia)、基因表達的正調控(positive regulation of gene expression)等生物過程相關。

圖5 GO富集分析柱形圖

3 討 論

二仙湯是現代經驗方，臨床應用廣泛，有研究表明其適用于陰陽失調引起的高血壓[12]，但具體作用機制仍有待研究。本研究運用網絡藥理學方法探索二仙湯治療高血壓潛在藥效成分、作用靶點及信號通路。二仙湯中補腎中藥淫羊藿、仙茅、巴戟天補腎氣，以固五臟之本，配上瀉熱中藥黃柏、知母及補血和血之當歸調理各臟腑氣血陰陽，以調和高血壓陰陽失調癥狀。既往研究表明淫羊藿、巴戟天有效成分有一定降壓效果，淫羊藿次苷Ⅱ具有降低自發性高血壓大鼠血壓作用，且能抑制心肌細胞凋亡[13]。

本研究通過在TCMSP數據庫中根據OB、DL值等指標檢索，得到候選藥效成分及相關作用靶點，再進一步借助軟件對二仙湯成分靶點信息進行網絡分析，從網絡圖中得到關鍵的藥效成分，其中槲皮素、去水淫羊藿素、β-谷甾醇、山柰酚等Degree值排名靠前，可能為二仙湯中降壓的主要藥效成分。槲皮素已被證實能作用于心血管系統且有降壓作用，有研究表明其能通過改善血管內皮依賴性松弛、抑制收縮反應起到降壓作用[14]。既往文獻記載淫羊藿素能通過促血管生成，改善內皮功能障礙治療高血壓[15]。β-谷甾醇具有降脂、抗炎、抗腫瘤、鎮痛等多種藥理作用[16]，其可能通過抑制炎癥反應發揮降壓作用。山柰酚可以通過舒張血管起到降壓作用[17]。通過PPI網絡構建得到二仙湯和高血壓的53個共同靶點基因，根據Degree和Betweeness Centrality同時大于均數的標準篩選得到6個關鍵靶點基因，分別為eNOS、TNF、TP53、AR、JUN、PTGS2。eNOS是存在于內皮細胞的內皮型一氧化氮合酶(NOS)，NOS以L-精氨酸為底物，利用氧合成一氧化氮(NO)。NO通過cGMP介導的信號轉導途徑參與血管平滑肌舒張，NO生物利用度的降低會導致內皮功能障礙與高血壓的形成[18]。TP53是一種抑癌基因，可以控制細胞生長和引發細胞凋亡。有研究結果表明miR-31a-5p和TP53是候選miRNA和高血壓調節基因，而TP53則是miR-31a-5p的虛擬靶基因，其結合位點位于未翻譯的TP53 3′(3′UTR)區域，miR-31a-5p通過加速動脈平滑肌增殖靶向TP53抑制細胞凋亡，從而參與高血壓的發生發展[19]。TNF會使體內內皮素-1(ET-1)等縮血管物質分泌增多，NO等舒張血管因子分泌減少，引起小動脈痙攣，血壓升高[20]。有動物實驗結果表明，雄激素/AR信號會加重大鼠高血壓，而抗雄激素治療可以降低大鼠血壓，證明AR與高血壓形成可能有一定關系[21]。有研究表明，PTGS2與女性高血壓的發病關系密切[22]。為進一步探討二仙湯潛在作用機制，本研究利用David數據庫對共同靶點基因進行富集得到可能作用的信號通路。研究發現，神經活性配體-受體相互作用通路[23]、TNF信號通路[24]、PI3K-Ak信號通路[25]、環鳥苷酸-蛋白激酶G信號通路(cGMP-PKG通路)[26]等是高血壓發病機制中重要的通路。除此之外，富集分析結果顯示二仙湯治療高血壓與信號轉導、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄正調控、對藥物的反應、對缺氧的反應、基因表達的正調控等生物過程相關。

本研究運用網絡藥理學技術對二仙湯治療高血壓的機制進行了系統分析，初步探索了二仙湯治療高血壓的活性成分、潛在作用靶點和潛在作用通路，為臨床應用提供了藥效物質基礎和研究方向，同時也為中藥治療高血壓提供了新的思路，但其具體作用機制有待進一步實驗驗證。